Verbesserte Kulturmethoden für patientenabgeleitete Tumorproben sind von entscheidender Bedeutung, da sich das Feld von der Verwendung konventioneller Zelllinien entfernt. Dieses Protokoll ermöglicht die In-vitro-Kultur von Patienten-abgeleiteten Tumorzellen in einer Plattform, die im Gegensatz zu in vivo Krebsmodellen einem hohen Durchsatz und einem hohen Gehalt zugänglich ist. Die Plattform mit PDXs ermöglicht es uns, heterogenere Systeme zu bewerten, die native Tumoren reflektieren.
Dies kann Einblicke in Arzneimittelmechanismen geben und ein schnelleres Drogenscreening ermöglichen. Die Methode könnte durch die Einbeziehung von Stroma, Endothel und Immunzellen erweitert werden. Diese Kokulturen könnten noch reflektierter über die einheimische Tumorpopulation und Architektur sein.
Üben Sie das Beladen der mikrofluidischen Platten mit leicht expandierten Zelllinien, um sehr kompetent zu werden, bevor Sie auf wertvollere Zellen wie PDXs umstellen. Die Ausrichtung während der Plattendosierung wirkt sich stark auf den Erfolg aus, und eine visuelle Demonstration kann dieses Konzept leicht vermitteln. Um zu beginnen, übertragen Tumorgewebe in eine vorgewogene sterile 50-Milliliter konische Röhre.
Spülen Sie sechsmal mit 30 Milliliter sterilen PBS, um Blut und Verunreinigungen zu entfernen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, und wiegen Sie das Tumorgewebe. Übertragen Sie das Tumorgewebe in eine 60-Millimeter-Runde Gewebekulturschale und verwenden Sie eine sterile Rasierklinge oder ein Skalpell, um es in Ein-Millimeter-Stücke zu zerkleinern.
Fügen Sie fünf Milliliter PDX-Verarbeitungsmedium hinzu, um die Tumorschlämme zu sammeln. Fügen Sie fünf Milliliter Dissoziationsenzymlösung hinzu, um die Tumorschlämme zu sammeln. Spülen Sie das Kulturgericht mit weiteren fünf Millilitern Dissoziationsenzymlösung.
Fügen Sie dann fünf Milliliter PDX-Verarbeitungsmedium hinzu. 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schütteln bebrüten. Auf halbem Weg durch die Inkubationszeit, wirbeln Sie das Rohr sanft.
Nach der Inkubation Pipette sanft mit einer serologischen Pipette auf und ab, um Klumpen aufzubrechen. Legen Sie ein 70-Mikrometer-Zellsieb über eine neue sterile 50-Milliliter-Röhre und filtern Sie die Zellen. Dann Zentrifuge bei 1, 200 U/min für zwei Minuten, um die Zellen zu pellet.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in zwei bis drei Milliliter PDX-Kulturmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Verwenden Sie diese Tabelle, um die erforderliche Anzahl der zugeordneten PDX-abgeleiteten Zellen zu schätzen, die erforderlich sind, um die gewünschte Zelldichte pro Chip zu erreichen.
Platte ein- bis zweimal 10 bis zu den sechs Zellen in fünf Millilitern PDX-Kulturmedium pro Brunnen einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. 48 Stunden bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit mit sanftem Schütteln bei 50 bis 55 Umdrehungen pro Minute inkubieren, um die Clusterbildung zu fördern. Nachdem sich die Cluster gebildet haben, fahren Sie mit der Zentrifugierung fort.
Bereiten Sie zunächst 20 Milliliter 100%Dichte Gradientenlösung durch gründliches Mischen von 18 Milliliter Dichte Gradient Zentrifugationslösung mit zwei Milliliter sterilen 10X HBSS in einem sterilen 50-Milliliter konischen Rohr. Verdünnen Sie diese 100%-Lösung mit sterilen 1X HBSS, um 10 Milliliter von je 20%30%40% und 55%dichte Gradientenlösungen herzustellen. Fügen Sie drei Milliliter mit einer 55%dichte Gradientenlösung an den Boden eines 15-Milliliter konischen Rohres.
Halten Sie das Rohr in einem Winkel, geben Sie langsam drei Milliliter 40%Dichte Gradient Lösung auf die abgewinkelte Seite des Rohres und auf der Oberseite der 55%-Schicht. Wiederholen Sie dies mit der 30%dichte Gradientenlösung. Dann sammeln Sie den Überstand der PDX-Rotationskulturen mit einer fünf Milliliter serologischen Pipette in ein Rohr und spülen die Plattenoberfläche sanft.
Zentrifugieren Sie bei 1 200 U/min für zwei Minuten, um Zellen zu pellet. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in drei Millilitern mit 20%Dichte Gradientenlösung wieder auf. Schichtung der 20%dichte Gradientenlösung mit Zellen auf der Oberseite des Farbverlaufs in der 15-Milliliter-Röhre.
Kappen Sie die Rohre und Zentrifuge in einer Schwenkschaufel-Rotorzentrifuge 30 Minuten bei vier Grad Celsius, 2.000 mal G und Null-Break. Nach der Zentrifugation sind Brüche sichtbar. Lebensfähige PDX-Zellkulturen finden sich in der Regel an der Schnittstelle für Gradientenmitarbeitslösungen mit 40 bis 55 %.
Sammeln Sie zwei bis drei Milliliter pro Fraktion in frische 15-Milliliter-Röhren. Fügen Sie drei bis vier Bände sterilen 1X HBSS zu jeder Fraktion hinzu und invertieren Sie gründlich. Zentrifuge bei 1.000 mal G für drei Minuten, um die Zellen zu pellet.
Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in ein bis zwei Milliliter PDX-Verarbeitungsmedium wieder auf. Übertragen Sie ein kleines Aliquot zwischen 50 bis 100 Mikroliter in eine Röhre, und fügen Sie ein gleiches Volumen der Dissoziationsenzymlösung für die Redissoziation hinzu.
Bewerten Sie die Zellennummer in der geclusterten Zellsuspension. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Rekonstituieren Sie Hyaluronsäure-Hydrogel-Lösungen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter HBSS in allen Brunnen in Beobachtungsfenstersäulen einer zweispurigen mikrofluidischen Platte hinzufügen, um die Kulturfeuchtigkeit und optimale Bildbedingungen aufrechtzuerhalten. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das für 50 Mikroliter Hydrogel bei der gewünschten Zelldichte benötigt wird, z. B. 5.000 Zellen pro Mikroliter. Für die Aussaat einer mikrofluidischen Platte wird das berechnete Volumen in jeweils vier sterile 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren einfließen lassen.
Stellen Sie den pH-Wert der HA-Thiol-Lösung unmittelbar vor der Anwendung auf acht mit 1 normalem Natriumhydroxid ein. Führen Sie eine Testgelation durch Mischen von 40 Mikroliter HA Thiol mit 10 Mikroliter PEGdA und Überwachung der Gelation im Laufe der Zeit. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension für zwei Minuten bei 200 mal G und Raumtemperatur, um die Zellen zu pellet.
Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie die Zellen in 40 Mikroliter HA-Thiol für ein 50-Mikroliter-Endvolumen wieder aus. Fügen Sie 10 Mikroliter PEGdA zu einem Aliquot der Zellen von HA Thiol hinzu. Gut mischen und ein bis drei Minuten warten, bevor Sie die mikrofluidische Platte säen.
Befestigen Sie einen Tipp für die Abgabe von 1,5 Mikrolitern auf eine einkanalige, sich wiederholende Pipette und laden Sie sie mit den Zellen in ha Hydrogellösung. Denken Sie daran, den Wasserstoff aliquot gut gemischt zu halten, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten. Um die mikrofluidische Platte auszusäen, richten Sie die Pipettespitze senkrecht zur Klinge aus, während Sie die Spitze vorsichtig in die Mitte des Geleinlasses legen, um kontaktzufinden, aber keinen Druck zu gewährleisten, wenn 1,5 Mikroliter Hydrogellösung dosiert werden.
Beobachten Sie den Füllstatus der mikrofluidischen Kanäle, indem Sie von der Oberseite der Platte, der Unterseite der Platte oder durch das Mikroskop betrachten. Bewerten Sie die Belastung anhand dieser Abbildung als Leitfaden. Eine Minute nach dem Laden, invertiert die Platte, während sie sich auf das nächste Aliquot vorbereiten.
Wiederholen Sie die Aussaat der mikrofluidischen Platte für die verbleibenden drei Aliquoten von Zellen in HA-Lösung. Nachdem alle Chips gefüllt sind, bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator 45 Minuten, bis die Gelation abgeschlossen ist. Danach stellen Sie mithilfe des mitgelieferten Handbuchs sicher, dass die Perfusionswippe im Zellkultur-Inkubator mit der richtigen Profusionseinstellung im 14-Grad-Winkel und vier Minuten-Intervallen installiert ist.
Fügen Sie 50 Mikroliter PDX-Zellkulturmedium zu allen mittleren Einlässe hinzu. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte an einer Oberfläche, um die Flüssigkeit zu ermutigen, die mikrofluidischen Kanäle zu füllen. Dann kippen Sie die Platte, um zu überprüfen, ob die Kanäle richtig gefüllt sind.
Fügen Sie 50 Mikroliter DMEM/F-12 für alle Medien hinzu. Wenn Luftblasen im Perfusionskanal gefangen sind, entfernen Sie durch sanftes Antippen der Platte gegen eine Oberfläche. Mit einem Mikroskop und Plattenlayout Form, Rekord Chip Füllung Erfolg.
Nicht ordnungsgemäß gefüllte Chips von der weiteren experimentellen Verwendung ausschließen. Platzieren Sie die Platte auf einer kippbaren Wippe, die auf eine 14-Grad-Neigung und einen Vier-Minuten-Zyklus eingestellt ist, um mit der Perfusion zu beginnen. Ersetzen Sie alle zwei Tage das PDX-Kulturmedium, zuerst 50 Mikroliter in den Einlässen, dann 50 Mikroliter in den Auslässen.
In dieser Studie wurde eine programmierbare Perfusionswippe in einem Standard-Inkubator für Wassermantel-Zellkultur installiert und zweispurige mikrofluidische Klingen wurden in einem Standard-Biosicherheitsschrank für die Beladung vorbereitet. Die Lebensfähigkeit und Morphologie der mikrofluidischen PDX-Kultur in 3D wurde sowohl unter ungetrennten als auch unter Dichtegradienten zentrifugationsgetrennten Bedingungen bewertet. Am ersten Tag zeigten jene Kulturen, die der Trennungsmethode unterzogen wurden, zehnmal weniger einzelne tote Zellen als ungetrennte Kulturen.
Wichtig ist, dass die getrennten Cluster hauptsächlich aus lebenden Zellen bestanden. Für die Clustergrößenverteilung wurde kein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt. Die Kulturen wurden sieben Tage lang in der mikrofluidischen Platte gepflegt.
Die Gesamtzahl der lebenden Zellen blieb konsistent, und Cluster behielten während des gesamten Lebenszyklus der Kultur etwa 80 % der Lebensfähigkeit bei. Denken Sie daran, dass jede PDX-Linie einzigartig ist, so dass die Einfache der Tumorverdauung, die phänotypische Größe und Morphologie von Clustern und die Position des Clusters innerhalb der Gradientenreinigung variieren. PDX-Kulturen, die mit dieser Methode hergestellt wurden, können mit bild- oder plattenleserbasierten Lebensfähigkeits-Assays, fixiert und immunfluoreszierend gekennzeichnet oder dissoziiert werden, um Zelllysate für andere Protokolle zu sammeln.
Die Methode wird es Forschern ermöglichen, die Tumormikroumgebung zu rekapitulieren, um die Biologie oder die medikamentöse Reaktion von Tumorzellen zu erforschen. Benutzer sollten Standard-Schulung für menschliche Probanden und blutübertragene Krankheitserreger-Training vor der Arbeit mit menschlichen Geweben. Entsprechende persönliche Schutzausrüstung sollte getragen werden.
