I metodi di coltura migliorati per i campioni di tumore derivati dal paziente sono di fondamentale importanza man mano che il campo si allontana dall'uso di linee cellulari convenzionali. Questo protocollo consente la coltura in vitro di cellule tumorali derivate dal paziente in una piattaforma suscettibile di elevata produttività e screening ad alto contenuto, a differenza dei modelli di cancro in vivo. La piattaforma che incorpora PDX ci consente di valutare sistemi più eterogenei che riflettono i tumori nativi.
Ciò può fornire informazioni sui meccanismi del farmaco e consentire uno screening più rapido dei farmaci. Il metodo potrebbe essere espanso attraverso l'incorporazione di stroma, endotelio e cellule immunitarie. Queste co-culture potrebbero essere ancora più riflettenti della popolazione tumorale nativa e dell'architettura.
Esercitati a caricare le piastre microfluidiche con linee cellulari facilmente espanse per diventare altamente abili prima di passare a celle più preziose come i PDX. L'allineamento durante l'erogazione delle lastre influisce notevolmente sul successo e una dimostrazione visiva può facilmente trasmettere questo concetto. Per iniziare, trasferire il tessuto tumorale in un tubo conico sterile pre-pesato da 50 millilitri.
Risciacquare sei volte con 30 millilitri di PBS sterile per rimuovere sangue e contaminanti. Rimuovere il più liquido possibile e pesare il tessuto tumorale. Trasferire il tessuto tumorale in un piatto rotondo di coltura tissutale di 60 millimetri e utilizzare una lama di rasoio sterile o un bisturi per tritarlo in pezzi di un millimetro.
Aggiungere cinque millilitri di mezzo di elaborazione PDX per raccogliere i liquami tumorali. Aggiungere cinque millilitri di soluzione enzimatica di dissociazione per raccogliere i liquami tumorali. Risciacquare il piatto di coltura con altri cinque millilitri di soluzione enzimatica di dissociazione.
Quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo di elaborazione PDX. Incubare 20 minuti a 37 gradi Celsius con tremori delicati. A metà del tempo di incubazione, ruotare delicatamente il tubo.
Dopo l'incubazione, pipettare su e giù delicatamente con una pipetta sierologica per rompere i grumi. Posizionare un filtro cellulare da 70 micron su un nuovo tubo sterile da 50 millilitri e filtrare le cellule. Quindi centrifugare a 1.200 giri/min per due minuti per pellettare le cellule.
Rimuovere il supernatante e resuspend in due o tre millilitri di mezzo di coltura PDX. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Utilizzare questa tabella per stimare il numero richiesto di celle derivate PDX associate necessarie per ottenere la densità di cella desiderata per chip.
Placcare da una a due volte 10 alle sei cellule in cinque millilitri di mezzo di coltura PDX per pozzo di una piastra di coltura tissutale a sei pozzi. Incubare per 48 ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e umidità del 95% con scuotimenti delicati a 50-55 giri/min per promuovere la formazione di cluster. Dopo che gli ammassi si sono formati, procedere alla centrifugazione.
Preparare innanzitutto 20 millilitri di soluzione gradiente di densità al 100% mescolando accuratamente 18 millilitri di soluzione di centrifugazione gradiente di densità con due millilitri di HBSS sterile 10X in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Diluire questa soluzione al 100% con HBSS sterile 1X per realizzare 10 millilitri ciascuno di soluzioni gradienti a densità 20%30%40% e 55%.. Aggiungere tre millilitri di soluzione gradiente di densità del 55% sul fondo di un tubo conico da 15 millilitri.
Tenendo il tubo ad angolo, erogare lentamente tre millilitri di soluzione gradiente di densità del 40% sul lato angolato del tubo e sopra lo strato del 55%. Ripetere con la soluzione gradiente di densità del 30%. Quindi raccogliere il supernatante delle colture di rotazione PDX con una pipetta sierologica da cinque millilitri in un tubo, risciacquando delicatamente la superficie della piastra.
Centrifuga a 1.200 giri/min per due minuti alle celle a pellet. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet di cella in tre millilitri di soluzione gradiente di densità del 20%. Sovrapporre con cura la soluzione gradiente di densità del 20% con le celle sulla parte superiore del gradiente nel tubo da 15 millilitri.
Corona i tubi e la centrifuga in una centrifuga del rotore a benna oscillante 30 minuti a quattro gradi Celsius, 2.000 volte G e zero break. Dopo la centrifugazione, le frazioni sono visibili. Le colture cellulari PDX vitali si trovano in genere nell'interfaccia della soluzione gradiente dal 40 al 55%.
Raccogliere da due a tre millilitri di ogni frazione in tubi freschi da 15 millilitri. Aggiungere da tre a quattro volumi di HBSS sterile 1X ad ogni frazione e invertire la miscela accuratamente. Centrifuga a 1.000 volte G per tre minuti per pellettare le cellule.
Rimuovere il supernatante. Rimossare il pellet cellulare in uno o due millilitri di mezzo di lavorazione PDX. Trasferire una piccola aliquota tra 50 e 100 microlitri in un tubo e aggiungere un volume uguale di soluzione enzimatica di dissociazione per la riassociazione.
Valutare il numero di cella nella sospensione della cella cluster. Contare le cellule con un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Ricostituire soluzioni idrogel di acido ialuronico secondo le istruzioni del produttore.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di HBSS a tutti i pozzi nelle colonne della finestra di osservazione di una piastra microfluidale a due corsie per mantenere l'umidità della coltura e le condizioni di imaging ottimali. Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per 50 microlitri di idrogel alla densità cellulare desiderata, ad esempio 5.000 celle per microlitro. Per la semina di una piastra microfluidale, aliquotare il volume calcolato in ciascuno dei quattro tubi sterili di centrifuga da 1,5 millilitri.
Regolare il pH della soluzione di tiolo HA a otto con 1 idrossido di sodio normale immediatamente prima dell'uso. Eseguire una gelazione di prova mescolando 40 microlitri di TIOLO HA con 10 microlitri di PEGdA e monitorando la gelazione nel tempo. Quindi, centrifugare le aliquote delle sospensioni cellulari per due minuti a 200 volte G e temperatura ambiente per pellettare le cellule.
Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare le cellule in 40 microlitri di tiolo HA per un volume finale di 50 microlitri. Aggiungere 10 microlitri di PEGdA a un'aliquota delle cellule di TIOLO. Mescolare bene e attendere da uno a tre minuti prima di seminare il piatto microfluidico.
Apporre una punta per l'erogazione di 1,5 microlitri a una pipetta ripetuta a canale singolo e caricare con le celle in soluzione di idrogel HA. Ricordarsi di mantenere l'aliquota dell'idrogeno ben miscelata per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Per seminare la piastra microfluidica, allineare la punta della pipetta perpendicolarmente alla lama posizionando delicatamente la punta al centro dell'ingresso del gel per garantire il contatto ma nessuna pressione quando si erogano 1,5 microlitri di soluzione di idrogel.
Osservare lo stato di riempimento dei canali microfluidici visualizzando dalla parte superiore della piastra, dal fondo della piastra o al microscopio. Valutare il caricamento utilizzando questa figura come guida. Un minuto dopo il caricamento, invertire la piastra mentre si prepara per l'aliquota successiva.
Ripetere la semina della piastra microfluidico per le restanti tre aliquote di cellule in soluzione DI. Dopo aver riempito tutti i trucioli, incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato 45 minuti fino al completamento della gelata. Successivamente, utilizzando il manuale fornito, assicurarsi che il rocker perfusione sia installato nell'incubatore di coltura cellulare con la corretta impostazione di profusione ad angolo di 14 gradi e intervalli di quattro minuti.
Aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura cellulare PDX a tutte le entrate medie. Toccare delicatamente la piastra contro una superficie per incoraggiare il liquido a riempire i canali microfluidici. Quindi capovolgere la piastra per verificare se i canali sono riempiti correttamente.
Aggiungere 50 microlitri di DMEM/F-12 per tutti i supporti. Se nel canale di perfusione sono intrappolate bolle d'aria, rimuovere toccando delicatamente la piastra contro una superficie. Utilizzando un modulo di layout del microscopio e della piastra, registra il successo del riempimento dei chip.
Escludere i trucioli riempiti in modo improprio da ulteriori usi sperimentali. Posizionare la piastra su un rocker basculante impostato su un'inclinazione di 14 gradi e un ciclo di quattro minuti per iniziare la perfusione. Ogni due giorni, sostituire il mezzo di coltura PDX, prima 50 microlitri nelle entrate, poi 50 microlitri nelle uscite.
In questo studio, un rocker perfusione programmabile è stato installato in un incubatore standard di coltura cellulare con giacca d'acqua e lame microfluidiche a due corsie sono state preparate in un armadio standard di biosicurezza per il carico. La vitalità e la morfologia della coltura PDX microfluidica 3D sono state valutate sia in condizioni non separate che in condizioni separate da centrifugazione gradiente di densità. Il primo giorno, quelle culture che hanno subito il metodo di separazione mostravano dieci volte meno singole cellule morte rispetto alle colture non separate.
È importante sottolineare che gli ammassi separati consistevano principalmente in cellule vive. Non è stata individuata alcuna differenza statisticamente significativa per la distribuzione delle dimensioni del cluster. Le colture sono state ulteriormente mantenute nella piastra microfluidico per sette giorni.
Il numero totale di cellule vive rimase costante e i cluster mantennero circa l'80% di vitalità per tutta la vita della cultura. Ricorda che ogni linea PDX è unica, quindi la facilità di digestione del tumore, le dimensioni fenotipiche e la morfologia degli ammassi e la posizione dell'ammasso all'interno della purificazione del gradiente varieranno. Le colture PDX stabilite con questo metodo possono essere testate con saggi di vitalità basati su immagini o lettori di lastre, fisse e immunofluorescenti o dissociate per raccogliere lisati cellulari per altri protocolli.
Il metodo consentirà ai ricercatori di ricapitolare il microambiente tumorale al fine di esplorare la biologia o la risposta farmacologica delle cellule tumorali. Gli utenti devono completare l'allenamento standard dei soggetti umani e l'allenamento degli agenti patogeni ematici prima di lavorare con tessuti di origine umana. Devono essere indossati adeguati dispositivi di protezione individuale.
