הפרוטוקול שלנו מספק מתודולוגיה חדשנית ליצירת פגיעה מוחית טראומטית בחולדות באמצעות הקרנה בלייזר כדי ליצור השפעה ממוקדת בקליפת המוח המוטורית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השונות הנמוכה באזור אוטם, שיעורי התמותה הנמוכים, ואת הפשטות היחסית של ההליך שאינו דורש מטפלים מומחים. מי שידגים את ההליך יהיה דמיטרי נתנאל, חוקר מהמעבדה שלנו.
כדי לבצע פגיעה מוחית הנגרמת על ידי לייזר, להקצות תחילה 20, 300 עד 350 גרם חולדות ספראג דאולי לתוך קבוצת הלייזר ו 20 לקבוצה שליטה שאם מופעל. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס נסיגה, מניחים חולדה אחת על כרית חימום מוסדר טמפרטורה רקטלי ולהשתמש מכונת גילוח כדי להסיר מספיק שיער מאתר הפציעה עם מרווח ללא שיער כשני סנטימטרים סביב החתך. לחטא את העור החשוף עם 70% אתנול ולהניח את החולדה במצב נוטה במחזיק ראש סטריאוטוקסי.
בצע חתך של שלושה סנטימטרים כדי לאפשר השתקפות הצדדית של הקרקפת לחשוף את האזור בין ברגמה למדה. החזקת לייזר Nd:YAG עם אורך גל שיא של 1064 ננומטר במרחק של שני מילימטרים מהגולגולת, לנהל 50 joules פעמים 10 נקודות עם משך פולס של שנייה אחת לאזור החשוף של הגולגולת מעל חצי הכדור הימני. לאחר הפציעה בלייזר נמסר, להסיר את החולדה מהמכשיר ולסגור את הקרקפת עם 3-0 תפרים כירורגיים משי.
לאחר מכן, מניחים את החולדה בכלוב שלה עם ניטור עד חקירה מלאה. 24 שעות לאחר ההליך, השתמש במערכת ניקוד של 43 נקודות כדי להעריך את ציון החומרה הנוירולוגית. בדיקת בעלי החיים לגירעונות נוירולוגיים, הפרעות התנהגות, משימת איזון קורות ורספלקסים, והקצאת ציונים גבוהים יותר למוגבלויות חמורות יותר.
לאחר ההערכה, לקצור את המוח מכל חיה ניסיונית ולשלוט על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי להעריך את נפח אוטם המוח, לחתוך את המוח שנקטף לתוך שש פרוסות coronal עבה שני מילימטר דגירה כל פרוסה ב 0.05% TTC במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הכתמים, סרוק פרוסות אלה באמצעות סורק אופטי ברזולוציה של 1600 על 1600 נקודות לאינץ'.
האזורים הבלתי נגועים בפרוסות המוח הקבועות מוגדרים כאוטמים. כדי להעריך את השכיחות של שבירת מחסום הדם מוח, 24 שעות לאחר הפציעה הנגרמת על ידי לייזר לטעון מזרק עם 2% אוונס צבע כחול מדולל בארבעה מיליליטר לקילוגרם של תמיסת מלח ולספק את הפתרון דרך הווריד פצועים ושליטה באמצעות וריד הזנב cannulateed. אפשר לפתרון להסתובב במשך שעה אחת לפני השימוש pincets כירורגי ומספריים כדי לפתוח את החזה של החיה הראשונה.
להחדיר את הלב החשוף עם 0.9% מלוחים מקורר דרך החדר השמאלי ב 110 מילימטרים של כספית של לחץ עד נוזל שפע חסר צבע נצפתה מן האולם הימני. לאחר מכן, לקצור את המוח ולקבל שתי פרוסות סיבתיות rostral מילימטר. הפרד את פרוסות המוח השמאליות מפרוסות המוח הימני כדי לאפשר הערכה של ההמיספרות הפצועות והבלתי פצועות בנפרד, ולשקול את הדגימות.
הומוגניזציה של הדגימות באמצעות מרגמה ועלי והדגירה דגימות הרקמה ב 50% חומצה טריכלורואצטית במשך 24 שעות. למחרת, צנטריפוגה דגימות רקמת המוח הומוגני במשך 20 דקות ב 10, 000 פעמים G וטמפרטורת החדר, ומערבבים מיליליטר אחד של supernatant עם 1.5 מיליליטר של 96% אתנול ביחס אחד עד שלושה. לאחר מכן, השתמש בגלאי פלואורסצנטיות בגירוש של 620 ננומטר ובאורך הגל של פליטת 680 ננומטר כדי להעריך את שבירת מחסום הדם.
כפי שנצפה על ידי ניתוח היסטולוגי, כתמים כחולים אוונס יכול לשמש כדי לחשוף את השכיחות של פגיעה מוחית בלייזר ובעלי חיים מודל MCAO. בניתוח מייצג זה לא נרשמו מקרי מוות או דימומים תת-ארגוניים בקבוצות הבקרה או בקבוצות הניסוי, ולקבוצה MCAO היה שיעור של 20% הן של תמותה והן של דימום תת-אנכרנואידי. גם שינויי טמפרטורת הגוף היחסיים בחולדות משתי הקבוצות היו דומים, למרות הבדל השונות של שתי הקבוצות.
ציוני החומרה הנוירולוגית היו גרועים משמעותית הן במודל הלייזר והן במודל MCAO בהשוואה לקבוצת הביקורת המופעלת על ידי Sham. פגיעה מוחית הנגרמת בלייזר גרמה גם לעלייה משמעותית בנפח האוטם בחצי הכדור היעד בהשוואה לקבוצת הביקורת המופעלת על ידי שאם. עם זאת, נפח אוטם של דגם הלייזר היה קטן יותר בהשוואה לבעלי החיים שנפצעו על ידי טכניקת MCAO.
אין הבדל בצקת המוח נצפתה בין מודל פגיעה מוחית הנגרמת על ידי לייזר לבין קבוצת הביקורת המופעלת על ידי שאם. עם זאת, היה הבדל משמעותי בצקת המוח בין מודל לייזר וקבוצות פצועים MCAO. בהשוואה לקבוצת הביקורת המופעלת על ידי שאם, הפגיעה המוחית הנגרמת בלייזר וטכניקות MCAO גרמו שניהם לעלייה משמעותית בשבר מחסום הדם בהמיספרות הלא פצועות והמטרה.
בעת ניסיון דגם זה, זכור למקד במדויק את אזור קליפת המוח המוטורית ולתקנן את האנרגיה, את מספר הנקודות המוקרנות ואת זמן האקספוזיציה הכולל. בעקבות הליך זה, שפע רחב של בדיקות התנהגותיות, כגון הליכה קרן, Froedert, והערכות אחרות ניתן לבצע.
