Protokolümüz, motor kortekste odak etkisi yaratmak için lazer ışınlama kullanan farelerde travmatik beyin hasarı yaratmak için yeni bir metodoloji sunmaktadır. Bu tekniğin en büyük avantajı enfarktüs alanındaki düşük değişkenlik, düşük mortalite oranları ve uzman işleyicileri gerektirmeyen prosedürün göreceli basitliğidir. Prosedürü gösteren Dmitry Natanel, bizim laboratuvardan bir araştırmacı olacaktır.
Lazer kaynaklı beyin hasarı gerçekleştirmek için, ilk olarak 20, 300 ila 350 gram Sprague Dawley sıçanı lazer grubuna, 20'sini ise Sham tarafından işletilen kontrol grubuna atayın. Çekilme refleksyanıt eksikliği doğruladıktan sonra, rektal sıcaklık düzenlenmiş ısıtma yastığı bir sıçan yerleştirin ve kesi etrafında yaklaşık iki santimetre saç serbest marjı ile yaralanma sitesinden yeterli saç kaldırmak için bir tıraş makinesi kullanın. Açıkta kalan deriyi %70 etanol ile dezenfekte edin ve fareyi stereotaksik bir kafa tutucuya yatkın konuma getirin.
Bregma ve lambda arasındaki alanı ortaya çıkarmak için kafa derisi lateral yansıması sağlamak için üç santimetrelik bir kesi olun. Kafatasından iki milimetre uzaklıkta 1064 nanometre lik en yüksek dalga boyuna sahip Nd:YAG lazeri tutarak, kafatasının sağ yarımkürenin üzerinde açıkta kalan bölgeye bir saniyelik darbe süresi yle 50 joule çarpı 10 nokta uygulayın. Lazer yaralanması yapıldıktan sonra fareyi cihazdan çıkarın ve kafa derisini 3-0 ipek cerrahi dikişlerle kapatın.
Sonra, tam recumbency kadar izleme ile kafesine sıçan yerleştirin. İşlemden 24 saat sonra, nörolojik şiddet skorunu değerlendirmek için 43 puanlık bir skorlama sistemi kullanın. Nörolojik açıkları için hayvanların test, davranış bozuklukları, ışın dengeleme görevi, ve refleksleri, ve daha ağır engelli için daha yüksek puanlar atama.
Değerlendirmeden sonra, standart protokollere göre her deney ve kontrol hayvan beyinleri hasat. Beyin enfarktüs hacmini değerlendirmek için, toplanan beyinleri altı milimetre kalınlığındaki koronal dilimlere bölve her dilimi 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca %0.05 TTC'de kuluçkaya yatırın. Boyama sonrasında, inç çözünürlüğü başına 1600 ile 1600 nokta ile bir optik tarayıcı ile bu dilimleri tarayın.
Sabit beyin dilimlerinin lekesiz bölgeleri enfarkt olarak tanımlanır. Kan beyin bariyeri kırılma sıklığını değerlendirmek için, 24 saat sonra lazer kaynaklı yaralanma yük% 2 Evans mavi boya tuzlu çözeltikilogram başına dört mililitre seyreltilmiş ve cannulated kuyruk damarı ile yaralı ve kontrol sıçanlara intravenöz çözüm teslim. İlk hayvanın göğsünü açmak için cerrahi pincets ve makas kullanmadan önce çözeltibir saat boyunca dolaşmak için izin verin.
Sağ atriyumdan renksiz profüzyon sıvısı gözlemlenene kadar sol ventrikül üzerinden 110 milimetre lik basınç ta ki soğumuş %0.9 tuzlu luk bir sıvı ile maruz kalabiyi perfüzyon. Sonra, beyin hasat ve iki milimetre rostral kaudal dilimler elde. Yaralı ve yaralanmamış hemisferlerin ayrı ayrı değerlendirilmesine olanak sağlamak için sol beyin dilimlerini sağ beyin dilimlerinden ayırın ve örnekleri tarttırın.
Bir harç ve havaneli kullanarak örnekleri homojenize ve 24 saat boyunca% 50 trikloroasetik asit doku örnekleri inkübül. Ertesi gün, homojenize beyin dokusu örneklerini 10,000 kez G ve oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj edin ve bir mililitre lik süpernatantı 1,5 mililitre ile karıştırın ve bir ila üç oranda %96 etanol. Daha sonra, 620 nanometre uyarma ve 680 nanometre emisyon dalga boyu kan beyin bariyeri kırılmasını değerlendirmek için bir floresan dedektörü kullanın.
Histolojik analizde gözlendiği gibi, Evans mavi boyama lazer ve MCAO model hayvanlarda beyin hasarı insidansını ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu temsili analizde kontrol veya deney gruplarında ölüm veya subaraknoid kanama kaydedilmemiş ve MCAO grubunda hem mortalite hem de subaraknoid kanama oranı %20 idi. Her iki gruptan sıçanlarda göreceli vücut ısısı değişiklikleri de benzer, her iki grubun değişkenlik bir fark rağmen.
Nörolojik şiddet skorları Hem lazer hem de MCAO modellerinde Sham tarafından işletilen kontrol grubuna göre anlamlı olarak kötüydü. Beyin hasarına lazerle bağlı olarak, sham tarafından işletilen kontrol grubuna kıyasla hedef yarımkürede enfarkt hacminde önemli bir artışa neden oldu. Ancak lazer modelinin enfarktüs hacmi MCAO tekniği ile yaralanan hayvanlara göre daha küçüktü.
Lazerle indüklenen beyin hasarı modeli ile Şam tarafından işletilen kontrol grubu arasında beyin ödemi nde fark gözlenmedi. Ancak, lazer modeli ve MCAO yaralı gruplar arasında beyin ödemi önemli bir fark vardı. Sham tarafından işletilen kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, lazer kaynaklı beyin hasarı ve MCAO teknikleri hem de olmayan yaralı ve hedef hemisferlerde kan beyin bariyeri kırılmasında önemli bir artışa neden oldu.
Bu modeli denerken, motor korteks alanını tam olarak hedeflemeyi ve enerjiyi, Radyasyona maruz kalanan nokta sayısını ve toplam sergilenme süresini standartlaştırmayı unutmayın. Bu prosedürü takiben, ışın yürüyüşü, Froedert ve diğer değerlendirmeler gibi çok sayıda davranışsal test yapılabilir.
