Наш протокол предоставляет новую методологию для создания черепно-мозговой травмы у крыс с помощью лазерного облучения, чтобы создать фокус воздействия в моторной коре. Основным преимуществом этого метода является низкая изменчивость в области инфаркта, низкие показатели смертности и относительная простота процедуры, которая не требует экспертных обработчиков. Демонстрацией процедуры будет Дмитрий Натанель, исследователь из нашей лаборатории.
Для выполнения лазерной индуцированной черепно-мозговой травмы, сначала назначить 20, 300 до 350 грамм Sprague Dawley крыс в лазерной группе и 20 для управления Шам-операции группы. После подтверждения отсутствия реакции на рефлекс вывода, поместите одну крысу на ректальной температуре регулируется нагревательной площадки и использовать бритву, чтобы удалить достаточно волос из травмы сайта с примерно два сантиметра волос свободной маржи вокруг разреза. Дезинфицировать обитаемую кожу 70%этанолом и поместить крысу в положение, подверженное стереотаксису, в держатель головы.
Сделайте трехметровый разрез, чтобы боковое отражение кожи головы выявило область между брегмой и ламбдой. Держа лазер Nd:YAG с пиковой длиной волны 1064 нанометров на расстоянии двух миллиметров от черепа, управлять 50 джоулей раз 10 точек с одной секундой пульс продолжительности открытой области черепа над правым полушарием. После того, как лазерная травма была доставлена, удалить крысу из устройства и закрыть кожу головы с 3-0 шелковых хирургических швов.
Затем поместите крысу в клетку с мониторингом до полного лежачих. Через 24 часа после процедуры используйте 43-балльную систему оценки для оценки неврологической тяжести. Тестирование животных на неврологические дефициты, нарушения поведения, луч балансировки задачи, и рефлексы, и присвоение более высокие баллы для более тяжелой инвалидности.
После оценки, урожай мозга от каждого экспериментального и контроля животных в соответствии со стандартными протоколами. Чтобы оценить объем инфаркта мозга, разделите собранные мозги на шесть двухмиллиметровых толщиной корональных ломтиков и инкубировать каждый кусочек в 0,05%TTC в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. После окрашивания сканируйте эти ломтики оптическим сканером с разрешением 1600 на 1600 точек на дюйм.
Необленые участки фиксированных ломтиков мозга определяются как инфаркт. Для оценки частоты разрыва гематоградного барьера, через 24 часа после лазерной индуцированной травмы загрузить шприц с 2%Evans синий краситель разбавлен в четыре миллилитров на килограмм солевого раствора и доставить раствор внутривенно раненых и контролировать крыс через канюли вену хвоста. Разрешить раствор циркулировать в течение одного часа, прежде чем использовать хирургические пинцеты и ножницы, чтобы открыть грудь первого животного.
Perfuse подвергаются сердце с охлажденным 0,9% солевого раствора через левый желудочек на 110 миллиметров ртутного столба давления до бесцветной жидкости изобилия наблюдается из правого атриума. Затем собрать мозг и получить два миллиметра ростральных хвостовых ломтиков. Отделяйте левые ломтики мозга от правых ломтиков мозга, чтобы позволить оценку раненых и не травмированных полушарий отдельно, и взвесить образцы.
Гомогенизировать образцы с помощью раствора и пестика и инкубировать образцы тканей в 50% трихлороацевой кислоты в течение 24 часов. На следующий день центрифугайте образцы гомогенизированной ткани мозга в течение 20 минут при температуре 10 000 Г и комнатной температуре и смешайте один миллилитр супернатанта с 1,5 миллилитров этанола 96% при соотношении один к трем. Затем используйте детектор флуоресценции при возбуждении 620 нанометров и длине волны выбросов 680 нанометров для оценки разрыва геммоэнергекторного барьера.
Как отмечается в гистологическом анализе, Эванс синий окрашивания могут быть использованы для выявить частоту черепно-мозговой травмы на лазерных и MCAO модели животных. В этом репрезентативном анализе ни в контрольных, ни в экспериментальных группах не было зарегистрировано ни смертей, ни субарахноидального кровоизлияния, а в группе МКАО было зарегистрировано 20% как смертности, так и субарахноидального кровоизлияния. Относительные изменения температуры тела у крыс из обеих групп были также похожи, несмотря на разницу в изменчивости обеих групп.
Неврологические оценки тяжести были значительно хуже в обоих лазерных и MCAO моделей по сравнению с Шам-операции контрольной группы. Лазерная травма, вызванная черепно-мозговой травмой, также привела к значительному увеличению объема инфаркта в целевом полушарии по сравнению с контрольной группой, работаемой в Шаме. Тем не менее, инфарктный объем лазерной модели был меньше по сравнению с животными, пострадавшими от техники MCAO.
Никакой разницы в отеке мозга не наблюдалось между лазерной индуцированной моделью черепно-мозговой травмы и контрольной группой, работаемой в Шаме. Тем не менее, существует значительная разница в отек мозга между лазерной модели и MCAO раненых групп. По сравнению с sham-управляемых контрольной группы, лазерной индуцированной черепно-мозговой травмы и МЕТОДЫ MCAO как вызвало значительное увеличение разрыва гем blood brain barrier в не-раненых и целевых полушарий.
При попытке этой модели, не забудьте точно целевой области моторной коры и стандартизировать энергию, количество точек облучения, и общее время экспозиции. После этой процедуры, большое множество поведенческих тестов, таких как луч ходьба, Froedert, и другие оценки могут быть выполнены.
