Nosso protocolo fornece uma nova metodologia para criar lesões cerebrais traumáticas em ratos usando irradiação a laser para criar um impacto focal no córtex motor. A principal vantagem dessa técnica são a baixa variabilidade na área infarto, as baixas taxas de mortalidade e a relativa simplicidade do procedimento que não requer manipuladores especializados. Demonstrando o procedimento será Dmitry Natanel, pesquisador do nosso laboratório.
Para realizar uma lesão cerebral induzida por laser, primeiro atribua 20, 300 a 350 gramas de ratos Sprague Dawley no grupo laser e 20 para o grupo controlado por Sham. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo de retirada, coloque um rato em uma almofada de aquecimento regulada pela temperatura reta e use um barbeador para remover cabelo suficiente do local da lesão com uma margem de aproximadamente dois centímetros livre de cabelo em torno da incisão. Desinfete a pele exposta com 70% de etanol e coloque o rato na posição propensa em um suporte de cabeça estereotaxic.
Faça uma incisão de três centímetros para permitir que o reflexo lateral do couro cabeludo exponha a área entre bregma e lambda. Segurando um laser Nd:YAG com comprimento de onda de pico de 1064 nanômetros a uma distância de dois milímetros do crânio, administre 50 joules vezes 10 pontos com uma duração de pulso de um segundo para a área exposta do crânio acima do hemisfério direito. Após a ção a laser, remova o rato do dispositivo e feche o couro cabeludo com suturas cirúrgicas de seda 3-0.
Em seguida, coloque o rato em sua gaiola com monitoramento até a completa recumbência. 24 horas após o procedimento, use um sistema de pontuação de 43 pontos para avaliar o escore de gravidade neurológica. Testar os animais para déficits neurológicos, distúrbios de comportamento, tarefa de balanceamento de feixes e reflexos, e atribuir pontuações mais altas para deficiências mais graves.
Após a avaliação, retire os cérebros de cada animal experimental e controle de acordo com os protocolos padrão. Para avaliar o volume de infarto cerebral, selado os cérebros colhidos em seis fatias coronais de dois milímetros de espessura e incubar cada fatia em 0,05% TTC por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a coloração, escaneie esta fatias com um scanner óptico com uma resolução de 1600 por 1600 pontos por polegada.
As áreas não manchadas das fatias cerebrais fixas são definidas como infartas. Para avaliar a incidência de quebra da barreira cerebral sanguínea, 24 horas após a lesão induzida pelo laser carregar uma seringa com corante azul evans de 2%Evans diluído em quatro mililitros por quilograma de solução salina e entregar a solução por via intravenosa aos ratos feridos e controlar os ratos através da veia da cauda cristalulada. Deixe a solução circular por uma hora antes de usar pincets cirúrgicos e tesouras para abrir o peito do primeiro animal.
Perfumar o coração exposto com salina resfriada de 0,9% através do ventrículo esquerdo a 110 milímetros de mercúrio de pressão até que um líquido de profusão incolor seja observado a partir do átrio direito. Em seguida, colher o cérebro e obter duas fatias caudais rostrais milímetros. Separe as fatias cerebrais esquerdas das fatias cerebrais direitas para permitir a avaliação dos hemisférios feridos e não feridos separadamente, e pese as amostras.
Homogeneize as amostras utilizando uma argamassa e pilão e incubar as amostras de tecido em ácido 50% tricloroacético por 24 horas. No dia seguinte, centrifugar as amostras de tecido cerebral homogeneizado por 20 minutos a 10.000 vezes g e temperatura ambiente, e misturar um mililitro do supernatário com 1,5 mililitros de 96% de etanol em uma ou três proporções. Em seguida, use um detector de fluorescência em uma excitação de 620 nanômetros e o comprimento de onda de emissão de 680 nanômetros para avaliar a quebra da barreira cerebral sanguínea.
Como observado pela análise histológica, a coloração azul de Evans pode ser usada para revelar a incidência de lesões cerebrais em animais modelo laser e MCAO. Nesta análise representativa não foram registrados óbitos ou hemorragias subaracnóides em grupos de controle ou experimentais, e o grupo MCAO apresentou uma taxa de 20% de mortalidade e hemorragia subaracnóide. As variações relativas da temperatura corporal nos ratos de ambos os grupos também foram semelhantes, apesar da diferença na variabilidade de ambos os grupos.
Os escores de gravidade neurológica foram significativamente piores tanto nos modelos laser quanto em MCAO em comparação com o grupo de controle operado por Sham. A lesão cerebral induzida pelo laser também causou um aumento significativo no volume de infarto no hemisfério alvo em comparação com o grupo de controle operado por Sham. No entanto, o volume de infarto do modelo laser foi menor em comparação com os animais feridos pela técnica MCAO.
Não foi observada diferença no edema cerebral entre o modelo de lesão cerebral induzida pelo laser e o grupo de controle operado por Sham. No entanto, houve uma diferença significativa no edema cerebral entre o modelo laser e os grupos lesados por MCAO. Em comparação com o grupo de controle operado por Sham, a lesão cerebral induzida pelo laser e as técnicas de MCAO causaram um aumento significativo na quebra da barreira cerebral no hemisfério não ferido e alvo.
Ao tentar este modelo, lembre-se de atingir precisamente a área do córtex motor e padronizar a energia, o número de pontos irradiados e o tempo total de exposição. Após este procedimento, uma ampla infinidade de testes comportamentais, como caminhada de vigas, Froedert e outras avaliações podem ser realizadas.
