שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח הקשורות ביטוי גנים מראה לנו בדיוק איך מבנה כרומטין משפיע על ביטוי גנים וכיצד ארגון כרומטין מווסת את הדינמיקה שעתוק. פיתחנו את הטכנולוגיה הזו כי רצינו להיות מסוגלים לשנות את הארכיטקטורה הכרומוזומלית כדי לאפשר יצירה של לולאת כרומטין ארוכת טווח. אמנם באותו זמן יש את היכולת להפוך את ההקשר כרומטין כדי לשחזר את המבנה כרומוזומלי אנדוגני.
שיטה זו תוכננה לנוחות השימוש וליישום רחב. ניצלנו דימרייזר לא רעיל, כמו גם מינים אורתוגונליים של dcas9 על מנת לאפשר למערכת לשמש באופן רחב יותר. פיתחנו שיטה זו מכיוון שרצינו להיות מסוגלים לענות על השאלה ארוכת השנים של תרנגולת וביצה האם ביטוי גנים מביא לארכיטקטורה כרומוזומלית או האם מבנה הכרומוזום מוביל לשינויים בביטוי הגנים.
עיצוב רצפי ה- RNA של מדריך CRISPR ותחזוקת תרבות התא מתוארים בפרוטוקול הטקסט. מפות פלסמיד והתווכים מנוצלים רשומים שם. התחל את ההכנה פלסמיד על ידי ערבוב חמישה מיקרוגרם של פלסמיד CRISPR lentiviral עם שלושה microliters של BsmB1 שלושה microliters של phosphatase אלקליין שישה microliters של חיץ עיכול 10x ו 0.6 microliters של טרי מוכן 100 מילימול של DTT.
מביאים את הנפח הכולל ל-60 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים ומדירים את התערובת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לעכל ולרסן את הפלסמיד. לאחר מכן, ג'ל לטהר את פלסמיד מתעכל בלולאה פלסמיד ומים מזוקקים כפול. לאחר מכן, הכינו תגובות חישול לזוגות ה-RNA המדריכיים.
שלב מיקרוליטר אחד של כל מדריך RNA ב 100 micromolar עם microliter אחד של חיץ קשירה 10x T4 6.5 microliters של מים מזוקקים כפולים ו 0.5 microliters של T4 PNK עבור נפח התגובה הכולל של 10 microliters. כדי anneal את המדריך RNA זוגות לרצפי היעד שלהם דגירה את תערובות ב 37 מעלות צלזיוס ב 30 דקות ואחריו דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ואז בהדרגה להפחית את הטמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס על ידי הפחתתו על ידי חמש מעלות צלזיוס לדקה. לאחר מכן, לדלל את RNAs מדריך annealed ב 1 עד מאתיים במים מזוקקים כפולים.
עכשיו, הכינו את שתי התגובות לרצועות. מערבבים מיקרוליטר אחד של הפלסמיד המתעכל עם 0.5 מיקרוליטרים של מדריך פריוונלי מדולל RNAse 2.5 מיקרוליטרים של מאגר רצועות 2x מיקרוליטר אחד של מים מזוקקים כפולים ו-0.5 מיקרוליטרים של רצועות. הדגירה את התגובות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי ligate המדריכים BsmB1 מתעכל פלסמיד.
לאחר מכן להפוך את פלסמיד קשירה חדש לתוך יציב שלושה חיידקים להגביר את החיידקים באמצעות כל שיטת הכנה פלסמיד. על צלחת שש בארות, לגם, זרע 750, 000 2n3 Tcells ב DMEM עם 10% FBS ו 1% עט סטרפטוקוקוס. השתמש באר אחת עבור כל מבנה דגירה התאים במשך 24 שעות.
למחרת, לשנות את המדיום לאנטיביוטיקה טרי חינם DMEM עם 10%FBS. מיד לאחר שינוי המדיום עבור כל באר של תאים מצופים להכין צינור של תערובת ייצור Lentivirus. לכל תגובה, לדלל 11 microliters של ריאגנט transfection בסיס השומנים עם 150 microliters של מדיום Opti-MEM עבור כל תגובה.
ואז בצינורות נפרדים להכין את ה-DNA. שלב שני מיקרוגרם של פלסמיד לוקטור lentiviral CLOud9 עם שני מיקרוגרם של רכיבי האריזה האחרים lentiviral. מדללים את התערובת ב-150 מיקרוליטרים של מדיום Opti-MEM.
לאחר מכן לשלב כמויות שוות של תערובת פלסמיד lentiviral מדולל בריג'נט transfection מבוססי השומנים מדולל להדגיר את תערובות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לכל באר של תאים להוסיף צינור אחד של תערובות מוכן ולהמשיך את הדגירה. 48 שעות לאחר מכן, להעביר את התקשורת הפקה ויראלי מ בארות הצלחת לתוך חרוט ולסובב אותם למטה ב 300 גרם במשך חמש דקות.
ואז להעביר את supernatant לצינורות טריים כדי להשליך את הפסולת גלולה. עכשיו, מיד להשתמש במדיה הייצור הנגיפי כדי להתמר את תאי היעד או להקפיא אותו ב 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. התחל עם הוספת 250 microliters של כל מבנה ויראלי של עניין, אשר במקרה זה, מורכב פלסמידים CLOud9 משלימים צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 80, 000 תאים.
לאחר מכן להוסיף מספיק פוליברין כך שהוא בין אחד לשמונה מיקרוגרם למיליליטר בתסרון. לאחר מכן התאימו את הנפח הכולל בכל צינור למיליליטר אחד באמצעות מדיה נטולת אנטיביוטיקה. עכשיו כדי להגביר את המגע בין חלקיקי הנגיף והתאים לסובב את התאים ב 800 גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
ואז להשעות מחדש את התאים ב supernatant על ידי צינורות. לאחר מכן, לטעון את ההשעיה של התאים על צלחות תרבות דגירה אותם במשך 24 שעות. למחרת, לאסוף את התאים.
צנטריפוגה אותם ב 300 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מחדש להשעות אותם במדיום רגיל. למחרת, מוסיפים puromycin ו hygromycin למדיום כדי לבחור עבור תאים מתומרים כפליים. הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה צריך להיקבע מראש עבור כל סוג תא.
לאחר מכן, הדגירה את התאים במדיה הבחירה לפחות שלושה ימים לפני שתמשיך עם יישומים במורד הזרם ולהמשיך לשמור על התאים ומדיית הבחירה. כדי לעמעם את התאים הנבחרים והתומרים של CLOud9, הוסף ABA מילימולרי אחד לצלחת התרבות. עבור פקדים, הוסף DMSO ולאחר מכן שמור את התאים עם ABA או DMSO למשך הניסוי.
כדי להפוך את העמעום, לשטוף את התאים עם מספיק PBS כדי לכסות את פני השטח של הצלחת פעמיים. לאחר מכן, תאי תרבות במדיה נטולת ABA כדי לשמור עליהם במצב לא מומר. שימוש הולם במערכת CLOud9 גורם למגע הפיך של מבני CSA ו- CSP CLOud9 משלימים באמצעות הוספה או הסרה של ABA למדיית תרבות תאים.
מבני CSA ו- CSP מותאמים לאזורים גנומיים מתאימים באמצעות מדריך CRISPR סטנדרטי RNAse. אימונופרציפציה כרומטין ואחריו PCR כמותי נוצל כדי להבטיח לוקליזציה מדויקת בפילוח של כל רכיב CLOud9. בנוסף coimmunoprecipation עם ובלי ABA מאומת CSA ו CSP עמעום בנוכחות הליגנד, כמו גם את הפיך בהעדר הליגנד.
לאחר עמעום ABA, מגע גדול יותר בין בטא גלובין לבין LCR נמדד על ידי לכידת אישור כרומוזום. עם זאת, זה לא נצפה בפקדים המכילים רק את CSA או רק את מבנה CSP. יצירת אינטראקציית בטא גלובין LCR לא לחלוטין לחסל את מגע גלובין LCR אנדוגני.
זה רק הוסיף איש הקשר המקורי. העלייה במגעי בטא-גלובין LCR נצפתה באמצעות 72 שעות של עמעום ללא קשר לאזור המדויק בתוך LCR ממוקד או אזור מקדם בטא גלובין. לבסוף, ההפיכה של המערכת אושרה עם לכידת אישור כרומוזום לאחר הסרת ABA.
זה הביא לחידוש מלא של האישור אנדוגני. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשנות מדיה ולהוסיף תאים מתומרים CLOud9 מעומעמים טריים מדי יום. אל תשכח לעבוד עם lentivirus יכול להיות מסוכן מאוד וכל אמצעי הזהירות המשמשים ב BSL 2 תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.
