פרוטוקולים אלה מאפשרים למשתמש לייצר מספר רב של אורגנואידים אשכים פונקציונליים מימטיים ואנדוקריניים מבחינה מבנית בסביבות נטולות ECM ו- DCM בתנאי תרבות דו-מימדיים או תלת-מימדיים. טכניקות אלה ניתנות לשחזור רב, מיושמות בקלות על הגדרות מעבדה ביולוגיות סטנדרטיות, ומשתמשות רק בכלים וחומרים נפוצים. אורגנואידים האשכים הם כלי חדשני להדמיית זרע ו אנדוקרינולוגיה הרבייה במבחנה, והוא עשוי יום אחד לאפשר את המחקר של גמטוגנזה במבחנה.
התחל על ידי הנחת עלה העכבר המתת חיטוי על מחצלת ניתוח ועיקור הבטן עם 70% אתנול. אוהל את העור של הבטן התחתונה עם מדפים ולפתוח אותו עם מספריים. אתר את האשכים באזורים הימניים והשמאליים התחתונים של הבטן וחתכו את הקשרים שלהם לאגרטלים וכל רקמת חיבור מעגנת.
ואז להרים את כל האשכים מהחיה. מניחים אותו בצלחת פטרי של BM שמצוי מראש. תחת מיקרוסקופ ניתוח, לעשות חתך קטן ב tunica albuginea בקצה אחד של כל האשכים עם מספריים ניתוח מיקרו קטן או על ידי קרע בעדינות עם שני מדפים עדין. תוך החזקת האשכים מהקצוות הנגדיים של החתך, לסחוט אותו בעדינות עם מדחפים עדין ולדחוף בתנועה גורפת לכיוון החור בטוניקה, אשר ישחרר את רקמת האשכים כמו חתיכה אחת מגולח.
חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות יותר. מניחים את החלקים למיליליטר אחד של פתרון דיסוציאציה לפני המלחמה אחד ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, בעדינות triturate את החלקים האשכים 50 פעמים עם פיפטה P1000.
ודאו שהפקעות נפרדות זו מהן ומהרקמה הבין-מערכתית. אם גושים נשארים, דגירה במשך חמש דקות נוספות ו triturate שוב. מוסיפים 33 מיקרוליטרים של תווי היאלאורונידס למיליליטר אחד של תערובת הדיסוציאציה.
ואז triturate 50 פעמים עם פיפטה P1000 ודגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, triturate אותו 50 פעמים עם פיפטה P200. לאחר הבטחת כי אין צינוריות גלוי או גושים של תאים קיימים, מרווה את אנזימי הדיסוציאציה על ידי הוספת FBS ל 10% מהנפח הכולל של המדגם triturate אותו מספר פעמים עם פיפטה P200.
הרטב את המרכז של מסננת תאים של 40 מיקרומטר עם מדיה ושוכך אותו משם, ולאחר מכן להוסיף את המדגם מסננת רטובה מראש ולסנן אותו כדי לייצר השעיה של תא יחיד. צנטריפוגה ההשעיה ב 100 פעמים g במשך שבע דקות. השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- BM טרי. לספור את התאים קיימא על hemocytometer באמצעות הדרה כחולה trypan, ואז מחדש צנטריפוגה מחדש resuspend אותם BM טרי. לתרבות דו-מימדית נטולת ECM, צלחת מתלים חד-תאיים ישירות על מגלשות תא ארבע בארות וממקמים את המגלשות באינקובטור של 35 מעלות צלזיוס.
לתרבות ה-ECM הדו-מימדית, מחלקים 100 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית מדוללת קרה של אחד לאחד לשקופית תאית של ארבע בארות, ומבטיחים שהג'ל יכסה את תחתית המנה. מניחים את השקופית באינקובטור למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר ל- ECM להפוך לפולימריזציה לג'ל, ולאחר מכן להוסיף את השעיית התא על גבי. לתרבות נטולת ECM תלת מימדית, מניחים מנות פטרי תלת מימדיות בצלחת תרבות של 24 בארות ומכסים אותן במיליליטר אחד של BM. תן את הכלים לצייד BM לפחות 30 דקות באינקובטור 35 מעלות צלזיוס, ואז להשליך את BM ולחזור על שיווי המשקל שוב עם מיליליטר אחד של BM טרי. הסר את כל BM מן הבאר ולחלק 200 microliters של BM טרי מסביב אבל לא בתוך ההפסקה המרכזית של צלחת פטרי 3D, ולאחר מכן לאסוף כל BM שנותר מתוך הפסקה זריעת התא המרכזי של מיקרו היטב להוסיף.
מחלקים את ההשעיה החד-תאית להפסקה המרכזית ומערבבים בעדינות למעלה ולמטה. מניחים את המנה לתוך חממה לחה 35 מעלות צלזיוס לתרבות. ביום שלמחר, לאט ובזהירות להסיר מדיה קיימת מרחבי צלחת פטרי 3D agarose ולהחליף עם מיליליטר אחד של BM טרי. האורגנואידים היו צריכים לדחוס בן לילה, ולאפשר להם לנוח בתחתית.
עבור תרבות ECM תלת-מימדית, הכן השעיה חד-תאית על-ידי שילוב חלקים שווים של ההשעיה של התא ב- BM עם ECM קר מופשר מראש. טריטוראט מספר פעמים כדי להבטיח שהוא מעורבב היטב. לאחר מכן מחלקים מיד את התערובת למגלשה קאמרית בת ארבע בארות, ומבטיחים שהיא מכסה את כל תחתית הצלחת.
דגירה שקופיות התא ב 35 מעלות צלזיוס ולאפשר את התוכן שלה כדי polymerize לפחות 30 דקות. לאחר הפילמור, להוסיף 500 microliters של BM על גבי התרבות. תרבות כל סוגי המודל האורגנואידים ב 35 מעלות צלזיוס.
עבור כל סוגי התרבות, החלף חצי מהמדיה שלהם עם BM טרי כל יומיים. פרוטוקול זה שימש להשגת דור האורגנואידים תוך 24 שעות באמצעות תאי אשכים של מורין לנוער. רקמות שנוצרו בהצלחה נצפו בתחילה כמו אשכולות תאים תלת-מימדיים.
בסביבות ECM, לאשכולות התאים היו שוליים ברורים בין האשכול לסביבתם הסובבת אותם. אשכולות תאים נצפו גם נודדים ברחבי ה- ECM ומתמזגים יחד. תרבות ה-ECM התלת-מימדית דרשה זמן רב יותר באופן משמעותי להרכבת מבני דה נובו מאשר כל שיטות התרבות האחרות.
ותרבות ללא ECM תלת מימדית ייצרה את האשכולות הגדולים ביותר עם אשכול אחד גדול וקומפקטי בתוך כל באר של צלחת פטרי 3D agarose. כדי להעריך אם המודלים האורגנואידיים דומים לרקמה המקורית, המבנים הביולוגיים נבדקו עבור סמנים ספציפיים לתאים והודמיו עם כשל חיסוני. השיטות הדו-ממדיות נטולות ה-ECM וה-ECM התלת-ממד ייצרו אורגנואידים עם מורפולוגיה פנימית מימטית מאוד של מידור האשכים.
ניתוח ארוך טווח בוצע על אורגנואידים מורכבים ללא ECM תלת-מימדי. האורגנואידים היו מתורבתים במשך 14 ימים ולאחר מכן נבדקו עבור סמנים ספציפיים לתאים ומבנה. מבנים דמויי תובל נצפו.
האורגנואידים נטולי ה-ECM התלת מימד נחקרו גם לתפקוד אנדוקריני בתרבות של 12 שבועות עם גירוי גונדוטרופין. טסטוסטרון ו inhibin B היו שניהם מכומתים מדיום מותנה organoid. לאחר 12 שבועות, גונדוטרופינים הוסרו במשך 48 שעות, גורם ריכוזי טסטוסטרון ו inhibin B לרדת.
כאשר גונדוטרופינים הוחזרו, שני ריכוזי ההורמונים גדלו באופן משמעותי, הוכחת היענות אנדוקרינית נכונה. הרכבה אורגנואידית מנצלת את ההתנהגות האוטונומית של תאים אשכים לא בוגרים בני קיימא. ניתן לתכנן בקלות ניסויים יצירתיים באמצעות תערובות תאים ממוינות או היברידיות מותאמות אישית.
לאחר זריעת תאים, ניתן להשתמש בהדמיית וידאו חי או בהדמיית זמן לשגות כדי לכמת הרכבה עצמית אורגנואידית. על פני תרבות, אורגנואידים ובינוני מצב ניתן לאסוף לניתוחים היסטולוגיים אמינו.
