Estos protocolos permiten al usuario producir un gran número de organoides testiculares funcionales estructuralmente miméticos y endocrinos en entornos libres de ECM y DCM en condiciones de cultivo 2D o 3D. Estas técnicas son altamente reproducibles, se aplican fácilmente a entornos de laboratorio biológicos estándar, y sólo utilizan herramientas y materiales comunes. Los organoides testiculares son una herramienta novedosa para simular la espermatogénesis y la endocrinología reproductiva in vitro, y algún día podrían permitir el estudio de la gametogénesis in vitro.
Comience colocando el ratón eutanizado supino en una estera de disección y esterilizando el abdomen con 70%etanol. Carpa la piel de la parte inferior del abdomen con fórceps y abrirlo con tijeras. Localice los testículos en las regiones inguinales inferiores izquierda y derecha del abdomen y corte sus conexiones con los vasos deferentes y cualquier tejido conectivo de anclaje.
A continuación, levante todos los testículos del animal. Colóquelo en un plato Petri de BM preequilibrado. Bajo un microscopio de disección, haz una pequeña incisión en la tunica albuginea en un extremo de cada testículo con pequeñas tijeras de micro disección o rasgando suavemente con dos fórceps finos. Mientras sostiene los testículos desde el extremo opuesto de la incisión, apriételo suavemente con fórceps finos y empuje en un movimiento de barrido hacia el agujero en la túnica, que liberará el tejido testicular como una pieza cohesiva.
Corta el tejido en trozos más pequeños. Coloque las piezas en un mililitro de solución de disociación precalentada uno e incubarlas a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, tritura suavemente las piezas de los testículos 50 veces con una pipeta P1000.
Asegúrese de que los túbulos se separan entre sí y del tejido intersticial. Si quedan grumos, incubar durante cinco minutos más y triturar de nuevo. Añadir 33 microlitros de solución de material de hialuronidasa por mililitro de la mezcla de disociación.
A continuación, triturar 50 veces con una pipeta P1000 e incubar la muestra a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, triturarlo 50 veces con una pipeta P200. Después de asegurarse de que no haya túbulos visibles o grupos de células, apague las enzimas de disociación añadiendo FBS al 10% del volumen total de la muestra y triturarlo varias veces con una pipeta P200.
Humedezca el centro de un colador celular de 40 micrómetros con medios y aspirarlo, luego agregue la muestra al colador pre-humedeido y filtre para producir una suspensión de una sola célula. Centrifugar la suspensión a 100 g durante siete minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en BM fresco. Contar las células viables en un hemocicómetro usando exclusión azul trypan, luego volver a centrifugarlas y resuspenderlas en BM fresco. Para el cultivo libre de ECM 2D, placa suspensión de una sola célula directamente en los portaobjetos de cuatro pozos de la cámara y coloque los portaobjetos en una incubadora de 35 grados Celsius.
Para el cultivo ECM 2D, dispensar 100 microlitros de medio de matriz extracelular diluido en frío uno a uno en un portaobjetos de cámara de cuatro pozos, asegurando que el gel cubra el fondo del plato. Coloque el portaobjetos en la incubadora durante un mínimo de 30 minutos para permitir que el ECM se polimerice en un gel y, a continuación, agregue la suspensión celular en la parte superior. Para una cultura libre de ECM 3D, coloque los platos de agarosa 3D Petri en un plato de cultivo de 24 pozos y cúbralos con un mililitro de BM. Deje que los platos se equilibren en BM durante al menos 30 minutos en una incubadora de 35 grados Celsius, luego deseche el BM y repita el equilibrio una vez más con un mililitro de BM fresco. Retire todo BM del pozo y dispensar 200 microlitros de BM fresco alrededor pero no dentro del hueco central de la placa 3D Petri, luego recoja cualquier BM restante desde el interior del hueco de siembra de la celda central del micro inserto de pozo.
Dispensar la suspensión de una sola célula en el hueco central y triturar suavemente hacia arriba y hacia abajo. Coloque el plato en una incubadora humidificada de 35 grados Celsius para el cultivo. Al día siguiente, retire lentamente y cuidadosamente los medios existentes de alrededor de la placa de agarosa 3D Petri y sustitúyalo con un mililitro de BM fresco. Los organoides deben haberse compactado durante la noche, lo que les permite descansar en la parte inferior.
Para el cultivo de ECM 3D, prepare una suspensión de una sola célula combinando partes iguales de la suspensión celular en BM con ECM predescongelado en frío. Triturar varias veces para asegurar que está bien mezclado. A continuación, dispensar inmediatamente la mezcla en un portaobjetos de cuatro pozos, asegurándose de que cubra toda la parte inferior de la placa.
Incubar los portaobjetos de la cámara a 35 grados centígrados y permitir que su contenido se polimerice durante al menos 30 minutos. Después de la polimerización, añadir 500 microlitros de BM en la parte superior del cultivo. Cultivo de todos los tipos de modelos organoides a 35 grados Celsius.
Para todos los tipos de cultivo, cambie la mitad de sus medios con BM fresco cada dos días. Este protocolo se utilizó para lograr la generación de organoides en 24 horas utilizando células testiculares murinas juveniles. Los tejidos generados con éxito se observaron inicialmente como grupos celulares 3D.
En entornos ECM, los clústeres de celdas poseían márgenes claros entre el clúster y su entorno circundante. También se observaron clústeres celulares para migrar a través del ECM y fusionarse. La cultura 3D ECM requirió mucho más tiempo para ensamblar estructuras de novo que todos los demás métodos de cultivo.
Y el cultivo libre de ECM 3D produjo los clusters más grandes con un solo racimo grande y compacto dentro de cada pozo de la agarosa Petri 3D. Para evaluar si los modelos organoides se asemejan al tejido nativo, las construcciones biológicas fueron sondeadas para marcadores específicos de la célula y visualizadas con inmunofluorescencia. Los métodos libres de ECM 2D y ECM 3D produjeron organoides con una morfología interna altamente mimética de compartimentación testicular.
Se realizó un análisis a largo plazo en los organoides ensamblados 3D sin ECM. Los organoides fueron cultivados durante 14 días y luego sondeados en busca de marcadores celulares y específicos de la estructura. Se observaron estructuras similares a tubulas.
Los organoides libres de ECM 3D también fueron estudiados para la función endocrina en un cultivo de 12 semanas con estimulación de gonadotropina. Testosterona e inhibición B se cuantificaron a partir de medio condicionado organoides. Después de 12 semanas, gonadotropinas fueron eliminados durante 48 horas, causando testosterona y concentraciones de inhibición B para disminuir.
Cuando se devolvieron las gonadotropinas, ambas concentraciones hormonales aumentaron significativamente, demostrando una capacidad de respuesta endocrina adecuada. El ensamblaje organoide aprovecha el comportamiento autónomo de las células testiculares inmaduras viables. Los experimentos creativos se pueden idear fácilmente mediante el uso de mezclas de celdas personalizadas ordenadas o híbridas.
Después de la siembra celular, se pueden utilizar imágenes de video en vivo o imágenes de lapso de tiempo para cuantificar el autoensamble organoide. En todo el cultivo, se pueden recolectar organoides y medios de condición para análisis histológicos y de ensayos amino.
