Bu protokoller, kullanıcının 2D veya 3D kültür koşullarında hem ECM hem de DCM içermeyen ortamlarda çok sayıda yapısal olarak mimetik ve endokrin fonksiyonel testis organoidi üretmesini sağlar. Bu teknikler son derece tekrarlanabilir, kolayca standart biyolojik laboratuvar ayarlarına uygulanan ve sadece ortak araç ve malzemeleri kullanır. Testis organoidleri spermatogenez ve üreme endokrinolojisi in vitro simüle etmek için yeni bir araçtır, ve bir gün in vitro gametogenesis çalışma sağlayabilir.
Bir diseksiyon mat üzerinde ötenazi fare supine yerleştirerek ve% 70 etanol ile karın sterilize ederek başlayın. Çadır forceps ile alt karın deri ve makas ile açın. Karın alt sol ve sağ inguinal bölgelerinde testisler bulmak ve vas deferens ve herhangi bir çapa bağ dokusu ile bağlantılarını kesti.
Sonra hayvan tüm testisleri kaldırın. Önceden dengede olan BM'den oluşan bir Petri kabına yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, küçük mikro diseksiyonu makasları ile ya küçük mikro diseksiyonu makas veya hafifçe iki ince forseps ile yırtılma ile her testis bir ucunda tunica albuginea küçük bir kesi yapmak. Kesinin karşı ucundan testis tutarken, yavaşça ince forseps ile sıkmak ve tunica deliğe doğru süpürme hareketi ile itin, tek bir uyumlu parça olarak testis dokusu serbest bırakacaktır.
Dokuyu daha küçük parçalara ayırın. Parçaları bir mililitre lik prewarm dissociation çözeltisine yerleştirin ve 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra testis parçalarını P1000 pipetle 50 kez hafifçe triturate edin.
Tübüllerin birbirinden ve interstisyel dokudan ayrı olduğundan emin olun. Kümeler kalırsa, beş dakika daha kuluçkaya yatve tekrar triturate. Dissosiasyon karışımının bir mililitrebaşına 33 mikrolitre hyaluronidase stok çözeltisi ekleyin.
Daha sonra P1000 pipetiyle 50 kez triturate ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece de örnek kuluçka. Kuluçkadan sonra, P200 pipetiyle 50 kez triturate. Görünür tübül veya hücre kümelerinin bulunmamasını sağladıktan sonra, numunenin toplam hacminin %10'una FBS ekleyerek dissosilasyon enzimlerini söndürün ve p200 pipetle birkaç kez triturate edin.
40 mikrometrelik hücre süzgecinin merkezini ortamla ısıtın ve aspire edin, sonra numuneyi önceden ıslak süzgeçe ekleyin ve tek hücreli süspansiyon üretmek için filtreleyin. Süspansiyonu 100 kez g olarak yedi dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve taze BM hücreleri resuspend. Trippan mavisi dışlama kullanarak bir hemositometre üzerinde canlı hücreleri saymak, sonra yeniden santrifüj ve taze BM onları resuspend. 2B ECM'siz kültür için, tek hücreli süspansiyonları doğrudan dört kuyulu oda slaytlarına yerleştirin ve slaytları 35 derece lik bir inkübatöre yerleştirin.
2B ECM kültürü için, jel çanak alt kapsar sağlanması, dört iyi bir oda slayt içine soğuk bire bir seyreltilmiş hücre dışı matriks orta 100 mikrolitre dağıtmak. ECM bir jel içine polimerize sağlamak için en az 30 dakika kuvöz de slayt yerleştirin, sonra üstüne hücre süspansiyon ekleyin. 3D ECM'siz bir kültür için agarose 3D Petri yemeklerini 24 kuyulu bir kültür kabına yerleştirin ve bir mililitre BM ile kaplayın. 35 derece lik bir kuvözde en az 30 dakika bm'de bulaşıkları dengeleyin, sonra BM'yi atın ve bir mililitre taze BM ile dengeyi bir kez daha tekrarlayın. Kuyudan tüm BM çıkarın ve etrafında taze BM 200 mikrolitre dağıtmak ama 3D Petri kabın merkezi girinti içinde değil, sonra mikro iyi eklemek merkezi hücre tohumlama girinti içinde kalan BM toplamak.
Tek hücreli süspansiyonu orta girintiye dağıtın ve hafifçe yukarı ve aşağı triturate. Kültür için nemlendirilmiş 35 derece santigrat kuvöz içine çanak yerleştirin. Ertesi gün, yavaş ve dikkatli bir şekilde agarose 3D Petri çanak çevresinde mevcut medya kaldırmak ve taze BM bir mililitre ile değiştirin. Organoidler bir gecede sıkıştırılmış olmalı, onları alt dinlenmeye izin.
3D ECM kültürü için, BM'deki hücre süspansiyonunun eşit kısımlarını soğuk önceden çözülmüş ECM ile birleştirerek tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Iyi karışık olduğundan emin olmak için birkaç kez triturate. Sonra hemen dört kuyulu bir oda slayt içine karışımı dağıtmak, bu plakanın tüm alt kapsar sağlanması.
35 santigrat derece oda slaytlar kuluçka ve içeriğini en az 30 dakika polimerize sağlar. Polimerizasyondan sonra, kültürün üstüne 500 mikrolitre BM ekleyin. Kültür tüm organoid model tipleri 35 santigrat derece.
Tüm kültür tipleri için, her iki günde bir yeni BM ile medyalarının yarısını değiştirin. Bu protokol, juvenil murine testis hücreleri kullanılarak 24 saat içinde organoid üretimi elde etmek için kullanılmıştır. Başarılı bir şekilde oluşturulan dokular başlangıçta 3D hücre kümeleri olarak gözlenmiştir.
ECM ortamlarında, hücre kümeleri küme ve çevre çevreleri arasında net kenar boşluklarına sahipti. Hücre kümelerinin de ECM boyunca göç edip kaynaşmaya başladıkları gözlenmiştir. 3D ECM kültürü, de novo yapılarını birleştirmek için diğer tüm kültür yöntemlerine göre önemli ölçüde daha fazla zamana ihtiyaç du.
Ve 3D ECM içermeyen kültür 3D agarose Petri çanak her kuyu içinde tek bir büyük ve kompakt küme ile en büyük kümeleri üretti. Organoid modellerin doğal dokuya benzeyip benzemediğini değerlendirmek için, biyolojik yapılar hücreye özgü belirteçler için incelenmiş ve immünoresans ile görselleştirilmiştir. 2D ECM ve 3D ECM içermeyen yöntemler, testis kompartmanizasyonunun yüksek mimetik bir iç morfolojisi olan organoidler üretti.
3D ECM içermeyen birleştirilmiş organoidler üzerinde uzun süreli analiz yapıldı. Organoidler 14 gün boyunca kültürlendi ve daha sonra hücre ve yapıya özgü belirteçler için incelendi. Tübül benzeri yapılar gözlendi.
3D ECM içermeyen organoidler de gonadotropin stimülasyonu ile 12 haftalık bir kültürde endokrin fonksiyon için çalışıldı. Testosteron ve inhibin B hem organoid klimalı ortamdan ölçüldü. 12 hafta sonra, gonadotropinler 48 saat boyunca çıkarıldı, testosteron ve inhibin B konsantrasyonlarının azalmasına neden.
Gonadotropinler geri verildiğinde, her iki hormon konsantrasyonu da önemli ölçüde artarak uygun endokrin duyarlılığı gösterdi. Organoid montaj canlı olgunlaşmamış testis hücrelerinin otonom davranışı yararlanır. Yaratıcı deneyler kolayca özelleştirilmiş hücre sıralanmış veya hibrid hücre karışımları kullanılarak icat edilebilir.
Hücre tohumlama sonrasında, canlı video görüntüleme veya zaman atlamalı görüntüleme organoid kendini montaj ölçmek için kullanılabilir. Histolojik ve amino analizler için kültür genelinde organoidler ve durum ortamı toplanabilir.
