Esses protocolos permitem ao usuário produzir um grande número de organoides testiculares funcionais estruturalmente miméticos e endócrinos em ambientes livres de ECM e DCM em condições de cultura 2D ou 3D. Essas técnicas são altamente reprodutíveis, facilmente aplicadas a configurações de laboratório biológicos padrão, e utilizam apenas ferramentas e materiais comuns. Organoides testiculares são uma nova ferramenta para simular endocrinologia endocrinologia reprodutiva in vitro, e podem um dia permitir o estudo da gametogênese in vitro.
Comece colocando o supino de rato eutanizado em um tapete de dissecção e esterilizando o abdômen com 70% de etanol. Tenda a pele do abdômen inferior com fórceps e abra-a com uma tesoura. Localize os testículos nas regiões inferior esquerda e direita do abdômen e corte suas conexões com os vasos deferidores e qualquer tecido conjuntivo de ancoragem.
Então levante todos os testículos do animal. Coloque-o em uma placa de Petri de BM pré-equilibrada. Sob um microscópio de dissecção, faça uma pequena incisão na tunica albuginea em uma extremidade de cada teste com uma pequena tesoura de micro dissecção ou rasgando suavemente com dois fórceps finos. Enquanto segura o testículo da extremidade oposta da incisão, aperte-o suavemente com fórceps finos e empurre em um movimento de varredura em direção ao buraco na tunica, que liberará o tecido testicular como uma peça coesa.
Corte o tecido em pedaços menores. Coloque as peças em um mililitro de solução de dissociação pré-dia e incuba-as a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, triturar suavemente as peças de testículos 50 vezes com uma pipeta P1000.
Certifique-se de que os túbulos se separem um do outro e do tecido intersticial. Se os aglomerados permanecerem, incubar por mais cinco minutos e triturar novamente. Adicione 33 microlitros de solução de estoque de hialuronidase por um mililitro da mistura de dissociação.
Em seguida, triturar 50 vezes com uma pipeta P1000 e incubar a amostra a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, tritura-a 50 vezes com uma pipeta P200. Depois de garantir que não há túbulos visíveis ou aglomerados de células, saciie as enzimas de dissociação adicionando FBS a 10% do volume total da amostra e tritura-a várias vezes com uma pipeta P200.
Molhe o centro de um coador de células de 40 micrômetros com mídia e aspire-o, em seguida, adicione a amostra ao coador pré-molhado e filtre-o para produzir uma suspensão unicelular. Centrifugar a suspensão a 100 vezes g por sete minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células em BM fresco. Conte as células viáveis em um hemócito usando a exclusão azul trypan, em seguida, re-centrífugas e resuspensá-las em BM fresco. Para a cultura livre de ECM 2D, as suspensões de placa única de células diretamente em lâminas de câmara de quatro poços e colocam os slides em uma incubadora de 35 graus Celsius.
Para cultura 2D ECM, dispense 100 microliters de meio de matriz extracelular diluído frio de um para um em um slide de câmara de quatro poços, garantindo que o gel cubra o fundo do prato. Coloque o slide na incubadora por um mínimo de 30 minutos para permitir que o ECM polimerize em um gel e adicione a suspensão da célula por cima. Para uma cultura 3D sem ECM, coloque pratos 3D Petri em uma placa de cultura de 24 poços e cubra-os com um mililitro de BM. Deixe os pratos equilibrados em MMC por pelo menos 30 minutos em uma incubadora Celsius de 35 graus, depois descarte o BM e repita o equilíbrio mais uma vez com um mililitro de BM fresco. Remova todo o BM do poço e dispense 200 microliters de BM fresco ao redor, mas não dentro do recesso central da placa 3D Petri, em seguida, coletar qualquer BM restante de dentro da célula central recesso de semeadura da inserção do micro poço.
Dispense a suspensão de célula única no recesso central e tritura suavemente para cima e para baixo. Coloque o prato em uma incubadora umidificada de 35 graus Celsius para a cultura. No dia seguinte, remova lentamente e cuidadosamente a mídia existente de toda a placa 3D Petri agarose e substitua por um mililitro de BM fresco. Os organoides deveriam ter compactado durante a noite, permitindo que descansassem na parte inferior.
Para a cultura 3D ECM, prepare uma suspensão unicelular combinando partes iguais da suspensão celular em BM com ECM pré-descongelado a frio. Triturar várias vezes para garantir que está bem misturado. Em seguida, dispense imediatamente a mistura em um slide de câmara de quatro poços, garantindo que ela cubra toda a parte inferior da placa.
Incubar os slides da câmara a 35 graus Celsius e permitir que seu conteúdo polimerize por pelo menos 30 minutos. Após a polimerização, adicione 500 microliters de MMC em cima da cultura. Cultura todos os tipos de modelo organoide a 35 graus Celsius.
Para todos os tipos de cultura, troque metade de seus meios de comunicação com BM fresco a cada dois dias. Este protocolo foi usado para alcançar a geração organoide dentro de 24 horas usando células testiculares murinas juvenis. Tecidos gerados com sucesso foram inicialmente observados como aglomerados de células 3D.
Em ambientes ECM, os aglomerados celulares possuíam margens claras entre o aglomerado e seu ambiente circundante. Também foram observados aglomerados celulares para migrar através do ECM e fundir-se juntos. A cultura 3D ECM exigiu significativamente mais tempo para montar estruturas de novo do que todos os outros métodos culturais.
E a cultura 3D livre de ECM produziu os maiores clusters com um único grande e compacto cluster dentro de cada poço da placa 3D agarose Petri. Para avaliar se os modelos organoides se assemelham ao tecido nativo, os construtos biológicos foram sondados para marcadores específicos de células e visualizados com imunofluorescência. Os métodos 2D ECM e 3D ECM produzidos organoides com uma morfologia interna altamente mimética de compartimentação testicular.
Foi realizada uma análise de longo prazo nos organoides montados sem ECM 3D. Os organoides foram cultivados por 14 dias e, em seguida, sondados para marcadores específicos de células e estruturas. Foram observadas estruturas semelhantes a túbulos.
Os organoides livres de ECM 3D também foram estudados para função endócrina em uma cultura de 12 semanas com estimulação de gonadotropina. Testosterona e inhibina B foram quantificadas do meio organoide. Após 12 semanas, as gonadotropinas foram removidas por 48 horas, fazendo com que as concentrações de testosterona e inhibin B diminuíssem.
Quando as gonadotropinas foram devolvidas, ambas as concentrações hormonais aumentaram significativamente, demonstrando a resposta endócrina adequada. A montagem organoide aproveita o comportamento autônomo de células testiculares imaturas viáveis. Experimentos criativos podem ser facilmente concebidos através do uso de misturas personalizadas de células classificadas ou híbridas.
Após a semeadura celular, imagens de vídeo ao vivo ou imagens de lapso de tempo podem ser usadas para quantificar a automontagem organoide. Em toda a cultura, organoides e meios de condição podem ser coletados para análises histológicas e de ensaios aminosinos.
