Эти протоколы позволяют пользователю производить большое количество структурно миметических и эндокринных функциональных органоидов яичек как в условиях, свободных от ЭКМ, так и в условиях 2D или 3D культуры. Эти методы воспроизводятся, легко применяются к стандартным биологическим лабораторным настройкам и используют только общие инструменты и материалы. Органоиды яичек являются новым инструментом для имитации сперматогенеза и репродуктивной эндокринологии в пробирке, и может в один прекрасный день позволить изучение в пробирке gametogenesis.
Начните с размещения усыпленной мыши на коврик для вскрытия и стерилизации живота с 70% этанола. Палатка кожи нижней части живота с миппами и открыть его ножницами. Найдите яички в нижних левых и правых паховых областях живота и разрежьте их соединения с сосудами deferens и любой якорной соединительной ткани.
Затем поднимите все яички от животного. Поместите его в чашку Петри предварительно equilibrated БМ. Под микроскопом вскрытия сделайте небольшой разрез в тунике альбугине на одном конце каждого яичка либо с небольшими микро-рассечением ножницами, либо нежно разрывая двумя мелкими типсами. Удерживая яичка с противоположного конца разреза, аккуратно сожмите его мелкими типсами и нажмите радикальным движением к отверстию в тунике, которое выпустит ткани яичка как один сплоченный кусок.
Ткань разрезать на более мелкие кусочки. Поместите кусочки в один миллилитр довоенного раствора диссоциации один и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После инкубации, осторожно тритурировать яички куски 50 раз с P1000 пипетки.
Убедитесь, что трубоубийки отделены друг от друга и от интерстициальной ткани. Если сгустки остаются, инкубировать в течение дополнительных пяти минут и тритурировать снова. Добавьте 33 микролитров раствора гиалуронидазы на один миллилитр диссоциарной смеси.
Затем тритурат 50 раз с P1000 пипетки и инкубировать образец при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. После инкубации, тритурировать его 50 раз с P200 пипетки. После обеспечения того, чтобы не было видимых трубок или скоплений клеток, утолить ферменты диссоциации, добавив FBS до 10% от общего объема образца и тритурировать его несколько раз с P200 пипетки.
Влажный центр 40 микрометровый ситечко клетки со средствами массовой информации и аспирировать его прочь, а затем добавить образец предварительно смочеется ситечко и фильтровать его для производства одноклеточной подвески. Центрифуга подвески при 100 раз г в течение семи минут. Откажитесь от супернатанта и повторно помеская клетки в свежем БМ. Подсчитайте жизнеспособные клетки на гемоцитометре, используя трипан синее исключение, затем повторно центрифуга и повторное использование их в свежем БМ. Для 2D ECM-свободной культуры, пластины одноклеточных суспензий непосредственно на четыре хорошо камеры слайдов и место слайдов в 35 градусов по Цельсию инкубатор.
Для 2D ECM-культуры, обойтись 100 микролитров холодного один к одному разбавленной внеклеточной матрицы среды в четыре хорошо камеры слайд, гарантируя, что гель охватывает блюдо дно. Поместите слайд в инкубатор в течение как минимум 30 минут, чтобы ECM полимеризуется в гель, а затем добавить подвеску клетки сверху. Для 3D ECM-свободной культуры, место агарозы 3D Петри блюда в 24-ну культуры блюдо и покрыть их с одним миллилитр БМ. Пусть блюда равноденствия в БМ, по крайней мере 30 минут в 35 градусов по Цельсию инкубатор, а затем отказаться от БМ и повторить equilibration еще раз с одним миллилитров свежего БМ. Удалите все БМ из хорошо и обойтись 200 микролитров свежих БМ вокруг, но не внутри центральной ниши 3D Петри блюдо, а затем собрать все оставшиеся БМ изнутри центральной ячейки посева углубление микро хорошо вставить.
Выделяйте одноклеточную подвеску в центральный углубление и аккуратно тритурировать вверх и вниз. Поместите блюдо в увлажненные 35 градусов по Цельсию инкубатор для культуры. На следующий день, медленно и осторожно удалить существующие средства массовой информации со всего агарозы 3D Петри блюдо и заменить один миллилитр свежего БМ. Органоиды должны были уплотняться на ночь, позволяя им отдыхать внизу.
Для 3D культуры ECM подготовьтесь к одноклеточной подвеске, сочетая равные части клеточной подвески в БМ с холодным предварительно оттаял ecM. Тритурат несколько раз, чтобы убедиться, что он хорошо смешивается. Затем немедленно вылейте смесь в четырех-хорошо камерной слайд, гарантируя, что она охватывает все дно пластины.
Инкубировать слайды камеры при 35 градусах по Цельсию и позволить его содержимому полимеризировать, по крайней мере 30 минут. После полимеризации добавьте 500 микролитров БМ поверх культуры. Культура всех видов органоидных моделей при 35 градусах по Цельсию.
Для всех типов культур, обмен половины своих средств массовой информации со свежимИ БМ каждые два дня. Этот протокол был использован для достижения органоидного поколения в течение 24 часов с использованием несовершеннолетних клеток яичка мурина. Успешно сгенерированные ткани первоначально наблюдались как кластеры 3D-клеток.
В средах ECM кластеры ячеек обладали четкой маржой между кластером и окружающей средой. Было также отмечено, что кластеры клеток мигрируют через ECM и объединяются. Культура 3D ECM требовала значительно больше времени для сборки структур de novo, чем все другие методы культуры.
А культура, свободная от 3D ECM, производила самые большие кластеры с одним большим и компактным скоплением в каждой колодец из 3D-блюда агарозы Петри. Для оценки того, напоминают ли органоидные модели родную ткань, биологические конструкции были исследованы для клеточных маркеров и визуализированы с помощью иммунофлуоресценции. Методы, свободные от 2D ECM и 3D ECM, производили органоиды с внутренней морфологией, высокомиметической разобщенной яичек.
Долгосрочный анализ был проведен на 3D ЭКМ-свободных собранных органоидов. Органоиды были культурны в течение 14 дней, а затем исследовали для клеток и структуры конкретных маркеров. Наблюдались трубчатые структуры.
Органоиды, свободные от 3D ECM, также изучались для эндокринной функции в 12-недельной культуре со стимуляцией гонадотропина. Тестостерон и инхибин B были количественно из органоидных условий среды. После 12 недель, гонадотропины были удалены в течение 48 часов, в результате чего тестостерон и inhibin B концентрации уменьшаются.
Когда гонадотропины были возвращены, концентрации гормонов значительно возросли, демонстрируя надлежащую эндокринную отзывчивость. Органоидная сборка использует автономное поведение жизнеспособных незрелых клеток яичек. Творческие эксперименты могут быть легко разработаны с помощью индивидуальных клеток отсортированы или гибридные смеси клеток.
После посева клеток для количественной оценки органоидной самосожжения можно использовать живую видеосъему или промежуток времени. По всей культуре, органоиды и состояние среды могут быть собраны для гистологических и амино анализ анализов.
