هذه البروتوكولات تمكن المستخدم من إنتاج عدد كبير من الخصية الخصية الوظيفية من الناحية الهيكلية و الغدد الصماء في كل من ECM وبيئات خالية من DCM في ظروف الثقافة 2D أو 3D. وهذه التقنيات قابلة للاستنساخ إلى حد كبير، وسهلة التطبيق على البيئات المختبرية البيولوجية القياسية، ولا تستخدم سوى الأدوات والمواد المشتركة. الخصية organoids هي أداة جديدة لمحاكاة الحيوانات المنوية والغدد الصماء التناسلية في المختبر، ويمكن أن تمكن يوم واحد من دراسة في المختبر gametogenesis.
تبدأ عن طريق وضع الماوس القتل الرحيم سوبين على حصيرة تشريح وتعقيم البطن مع 70٪ الإيثانول. خيمة جلد أسفل البطن مع ملقط وفتحه مع مقص. حدد مكان الخصية في المناطق الأربية السفلية اليسرى والأيمنية من البطن وقطع اتصالاتها بأوعية الأوعية وأي أنسجة الضامة الرسو.
ثم ارفع الخصيات بأكملها من الحيوان. وضعه في طبق بيتري من BM قبل التوازن. تحت مجهر تشريح، وجعل شق صغير في albuginea tunica على نهاية واحدة من كل الخصية مع مقص تشريح صغير أو عن طريق تمزيق بلطف مع اثنين من ملقط غرامة. أثناء عقد الخصية من الطرف المقابل من الشق ، اضغط عليه بلطف مع ملقط ناعم ودفع في حركة كاسحة نحو الثقب في التونيكا ، والتي ستطلق الأنسجة الخصية كقطعة واحدة متماسكة.
قطع الأنسجة إلى قطع أصغر. ضع القطع في ملليلتر واحد من محلول الانفصام قبل الالدفء واحد واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة، triturate بلطف قطع الخصيات 50 مرات مع ماصة P1000.
تأكد من أن الأنابيب منفصلة عن بعضها البعض وعن الأنسجة الخلالية. إذا بقيت كتل، احتضان لمدة خمس دقائق إضافية و triturate مرة أخرى. إضافة 33 ميكرولترات من محلول الأسهم هيالورونيداز لكل ملليلتر واحد من خليط الانفصام.
ثم triturate 50 مرات مع ماصة P1000 واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، اُعيد 50 مرة مع ماصة P200. بعد التأكد من عدم وجود أنابيب مرئية أو كتل من الخلايا ، أطفئ إنزيمات الانفصام عن طريق إضافة FBS إلى 10 ٪ من الحجم الإجمالي للعينة وتاخر عدة مرات مع ماصة P200.
الرطب في مركز مصفاة 40 ميكرومتر مع وسائل الإعلام وpirate بعيدا، ثم إضافة العينة إلى مصفاة قبل ترطيب وتصفية لإنتاج تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي تعليق في 100 مرة ز لمدة سبع دقائق. تجاهل افرا و resuspend الخلايا في BM الطازجة. عد الخلايا القابلة للحياة على مقياس للهيموسيت باستخدام الاستبعاد الأزرق trypan، ثم إعادة الطرد المركزي وإعادة تعليقها في BM جديدة. بالنسبة للثقافة الخالية من ECM 2D ، يتم تعليق اللوحة أحادية الخلية مباشرة على شرائح الغرفة ذات الأربعآبار ووضع الشرائح في حاضنة درجة مئوية 35.
لثقافة ECM 2D ، الاستغناء عن 100 ميكرولترات من المصفوفة الباردة المخففة واحد إلى واحد خارج الخلية المتوسطة في شريحة غرفة أربعة بئر ، وضمان أن يغطي الجل قاع الطبق. ضع الشريحة في الحاضنة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة للسماح لـ ECM بالتمرمر إلى هلام ، ثم إضافة تعليق الخلية على القمة. لثقافة 3D ECM خالية، ضع أطباق agarose 3D Petri في طبق ثقافة 24 بئرًا واغطيها بميليلتر واحد من BM. السماح للأطباق توازن في BM لمدة 30 دقيقة على الأقل في حاضنة درجة مئوية 35، ثم تجاهل BM وتكرار التوازن مرة أخرى مع ملليلتر واحد من BM الطازجة. إزالة جميع BM من البئر والاستغناء عن 200 ميكرولترات من BM الطازجة حول ولكن ليس داخل عطلة مركز طبق بيتري 3D، ثم جمع أي BM المتبقية من داخل خلية مركز بذر عطلة من إدراج جيدا الدقيقة.
الاستغناء عن تعليق خلية واحدة في عطلة مركز و triturate بلطف صعودا وهبوطا. ضع الطبق في حاضنة مرطبة 35 درجة مئوية للثقافة. في اليوم التالي، ببطء وبعناية إزالة وسائل الإعلام الموجودة من حول صحن agarose 3D بيتري واستبدالها بميليلتر واحد من BM الطازجة. يجب أن تكون الأعضاء مضغوطة بين عشية وضحاها ، مما يسمح لهم بالراحة في القاع.
بالنسبة لثقافة ECM ثلاثية الأبعاد، قم بإعداد تعليق أحادي الخلية عن طريق الجمع بين أجزاء متساوية من تعليق الخلية في BM مع ECM الباردة المذابة مسبقًا. Triturate عدة مرات لضمان أنها مختلطة بشكل جيد. ثم الاستغناء فورا الخليط في شريحة غرفة أربعة بئر، وضمان أنه يغطي الجزء السفلي بأكمله من لوحة.
احتضان الشرائح الغرفة في 35 درجة مئوية والسماح لمحتوياتها البلمرة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد البلمرة، إضافة 500 ميكرولترات من BM على رأس الثقافة. ثقافة جميع أنواع نموذج organoid في 35 درجة مئوية.
لجميع أنواع الثقافة، وتبادل نصف وسائل الإعلام الخاصة بهم مع BM الطازجة كل يومين. وقد استخدم هذا البروتوكول لتحقيق توليد العضوية في غضون 24 ساعة باستخدام خلايا الخصية المورين الأحداث. وقد لوحظت الأنسجة التي تم إنشاؤها بنجاح في البداية كتجمعات خلايا ثلاثية الأبعاد.
في بيئات ECM، تملك كتل الخلية هوامش واضحة بين الكتلة والبيئة المحيطة بها. ولوحظ أيضا أن مجموعات الخلايا تنتقل عبر إدارة المحتوى في الـ ECM وتصهر بعضها البعض. تتطلب ثقافة 3D ECM وقتًا أطول لتجميع هياكل de novo أكثر من جميع أساليب الثقافة الأخرى.
وأنتجت الثقافة 3D ECM خالية من أكبر المجموعات مع مجموعة واحدة كبيرة وصغيرة داخل كل بئر من 3D agarose بيتري الطبق. لتقييم ما إذا كانت النماذج العضوية تشبه الأنسجة الأصلية ، تم فحص الانشاءات البيولوجية لعلامات خاصة بالخلايا وتصورها مع الفلوروسين المناعي. أنتجت الأساليب 2D ECM و 3D ECM الخالية من العضية مع مورفولوجيا داخلية محاكاة عالية من تجزئة الخصية.
تم إجراء تحليل طويل الأجل على الأعضاء المجمعة 3D ECM خالية. تم استزراع الأعضاء لمدة 14 يومًا ثم تم فحصها بحثًا عن علامات خاصة بالخلية والهيكل. ولوحظت هياكل تشبه الأنابيب.
كما تمت دراسة الأعضاء 3D ECM خالية من وظيفة الغدد الصماء في ثقافة 12 أسبوعا مع التحفيز gonadotropin. التستوستيرون وinhibin B على حد سواء كميا من المتوسطة organoid مكيفة. بعد 12 أسابيع, تمت إزالة gonadotropins لمدة 48 ساعة, مما تسبب في التستوستيرون وتركيزات inhibin B إلى الانخفاض.
عندما عاد gonadotropins, كل من هرمون تركيزات زيادة كبيرة, مما يدل على الاستجابة السليمة للغدد الصماء. الجمعية العضوية يستفيد من السلوك الذاتي للخلايا الخصية غير ناضجة قابلة للحياة. يمكن بسهولة ابتكار التجارب الإبداعية من خلال استخدام خلية مخصصة مفروزات الخلية أو الهجين.
بعد البذر الخلية، يمكن استخدام التصوير الفيديو الحي أو التصوير الفاصل الزمني لتحديد حجم التجميع الذاتي العضوي. عبر الثقافة، يمكن جمع organoids ومتوسطة الشرط لتحليلات التحاليل النسيجية والأمينية.
