Diese Protokolle ermöglichen es dem Anwender, eine große Anzahl von strukturell mimetischen und endokinen funktionellen Hodenorganoiden sowohl in ECM- als auch in DCM-freien Umgebungen unter 2D- oder 3D-Kulturbedingungen herzustellen. Diese Techniken sind sehr reproduzierbar, leicht auf biologische Standardlaboreinstellungen anzuwenden und verwenden nur gängige Werkzeuge und Materialien. Hodenorganoide sind ein neuartiges Werkzeug zur Simulation der Spermatogenese und der reproduktiven Endokrinologie in vitro und könnten eines Tages die Untersuchung der In-vitro-Gametogenese ermöglichen.
Beginnen Sie, indem Sie die eingeschläferte Maus-Supine auf eine Seziermatte legen und den Bauch mit 70% Ethanol sterilisieren. Die Haut des Unterbauchs mit Zangen aufstellen und mit einer Schere öffnen. Suchen Sie die Hoden in den unteren linken und rechten Leistenregionen des Bauches und schneiden Sie ihre Verbindungen zu den Vas deferens und jedem verankernden Bindegewebe.
Dann heben Sie die gesamten Hoden vom Tier. Legen Sie es in eine Petrischale aus vorausgeglichenen BM. Unter einem Seziermikroskop einen kleinen Schnitt in der Tunika albuginea an einem Ende jedes Hodens entweder mit einer kleinen Mikrosektionsschere oder durch sanftes Reißen mit zwei feinen Zangen machen. Während Sie die Hoden vom anderen Ende des Einschnitts halten, drücken Sie sie vorsichtig mit feiner Zange und schieben Sie sie in einer schwungvollen Bewegung in Richtung des Lochs in der Tunika, das das Hodengewebe als ein kohäsives Stück freisetzt.
Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Stücke. Legen Sie die Stücke in einen Milliliter Vorwärmedissoziationslösung ein und bebrüten Sie sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Inkubation die Hodenstücke 50 Mal mit einer P1000 Pipette sanft trituieren.
Stellen Sie sicher, dass sich die Tubuli voneinander und vom interstitiellen Gewebe trennen. Wenn Klumpen bleiben, für weitere fünf Minuten inkubieren und wieder trituieren. Fügen Sie 33 Mikroliter Hyaluronidase-Stammlösung pro Milliliter der Dissoziationsmischung hinzu.
Dann trituieren Sie 50 Mal mit einer P1000 Pipette und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Nach der Inkubation 50 Mal mit einer P200 Pipette trituieren. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass keine sichtbaren Tubuli oder Zellklumpen vorhanden sind, löschen Sie die Dissoziationsenzyme, indem Sie FBS zu 10 % des Gesamtvolumens der Probe hinzufügen und sie mehrmals mit einer P200-Pipette trituieren.
Befeuchten Sie die Mitte eines 40-Mikrometer-Zellsiebes mit Medien und aspirieren Sie es weg, fügen Sie die Probe dann dem vorbenetzten Sieb hinzu und filtern Sie sie, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 100 mal g für sieben Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in frischem BM wieder auf. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypanblau-Ausschluss, dann zentrifugieren und setzen Sie sie in frischem BM wieder aus. Für 2D ECM-freie Kultur, Platte einzellige Suspensionen direkt auf Vier-Well-Kammer-Dias und legen Sie die Dias in einem 35 Grad Celsius Inkubator.
Für die 2D-ECM-Kultur 100 Mikroliter kaltes eins-zu-eins verdünntes extrazelluläres Matrixmedium in eine Vier-Well-Kammerrutsche geben, um sicherzustellen, dass das Gel den Tellerboden bedeckt. Legen Sie das Dia für mindestens 30 Minuten in den Inkubator, damit das ECM in ein Gel polymerisiert, und fügen Sie dann die Zellsuspension oben hinzu. Für eine 3D ECM-freie Kultur, legen Sie Agarose 3D Petri-Gerichte in ein 24-Well-Kulturgericht und decken Sie sie mit einem Milliliter BM. Lassen Sie die Gerichte in BM für mindestens 30 Minuten in einem 35 Grad Celsius Inkubator aushalten, dann entsorgen Sie die BM und wiederholen Sie die Ausgleiche noch einmal mit einem Milliliter frischer BM. Entfernen Sie alle BM aus dem Brunnen und geben Sie 200 Mikroliter frische BM um, aber nicht innerhalb der mittleren Aussparung der 3D Petrischale, dann sammeln Sie alle verbleibenden BM aus dem Inneren der Mittleren Zelle Saat aus dem Mikrobrunneneinsatz.
Geben Sie die einzellige Aufhängung in die mittlere Aussparung und trituieren Sie sanft nach oben und unten. Legen Sie das Gericht in einen befeuchteten 35 Grad Celsius Brutkasten für Kultur. Am nächsten Tag, langsam und sorgfältig entfernen vorhandene Medien aus der Agarose 3D Petrischale und ersetzen mit einem Milliliter frischen BM. Die Organoide sollten über Nacht verdichtet haben, so dass sie am Boden ruhen können.
Für die 3D-ECM-Kultur bereiten Sie eine einzellige Suspension vor, indem Sie gleiche Teile der Zellsuspension in BM mit kaltem vorgetautem ECM kombinieren. Trituieren Sie mehrmals, um sicherzustellen, dass es gut gemischt ist. Geben Sie das Gemisch dann sofort in eine Vier-Well-Kammerrutsche, um sicherzustellen, dass es den gesamten Boden der Platte bedeckt.
Inkubieren Sie die Kammer bei 35 Grad Celsius und lassen Sie ihren Inhalt für mindestens 30 Minuten polymerisieren. Nach der Polymerisation 500 Mikroliter BM zusätzlich zur Kultur hinzufügen. Kultur alle organoiden Modelltypen bei 35 Grad Celsius.
Für alle Kulturtypen tauschen Sie alle zwei Tage die Hälfte ihrer Medien mit frischem BM aus. Dieses Protokoll wurde verwendet, um organoide Erzeugung innerhalb von 24 Stunden mit juvenilen murinhorischen Hodenzellen zu erreichen. Erfolgreich erzeugtes Gewebe wurde zunächst als 3D-Zellcluster beobachtet.
In ECM-Umgebungen besaßen die Zellcluster klare Ränder zwischen dem Cluster und seiner Umgebung. Zellcluster wurden auch beobachtet, um über das ECM zu migrieren und miteinander zu verschmelzen. Die 3D-ECM-Kultur benötigte deutlich mehr Zeit, um de novo-Strukturen zusammenzustellen als alle anderen Kulturmethoden.
Und die 3D-ECM-freie Kultur produzierte die größten Cluster mit einem einzigen großen und kompakten Cluster in jedem Brunnen der 3D-Agarose Petrischale. Um zu beurteilen, ob die Organoidmodelle dem nativen Gewebe ähneln, wurden die biologischen Konstrukte auf zellspezifische Marker untersucht und mit Immunfluoreszenz visualisiert. Die 2D-ECM- und 3D-ECM-freien Methoden produzierten Organoide mit einer inneren Morphologie, die die Hodenkompartimentialisierung stark mimetisch war.
Eine Langzeitanalyse wurde an den 3D ECM-freien zusammengesetzten Organoiden durchgeführt. Die Organoide wurden 14 Tage lang kultiviert und dann auf zell- und strukturspezifische Marker untersucht. Tubule-ähnliche Strukturen wurden beobachtet.
Die 3D ECM-freien Organoide wurden auch für die endokrine Funktion in einer 12-Wochen-Kultur mit Gonadotropin Stimulation untersucht. Testosteron und Inhibin B wurden beide aus organoid-konditionierten Medium quantifiziert. Nach 12 Wochen, Gonadotropine wurden für 48 Stunden entfernt, was testosteron und Inhibin B-Konzentrationen zu verringern.
Wenn die Gonadotropine zurückgegeben wurden, beide Hormonkonzentrationen deutlich erhöht, zeigt richtige endokrine Reaktionsfähigkeit. Organoid-Montage nutzt das autonome Verhalten lebensfähiger unreifer Hodenzellen. Kreative Experimente lassen sich einfach mit kundenspezifischen zellsortierten oder hybriden Zellmischungen entwickeln.
Nach der Zellaussaat können Live-Videoaufnahmen oder Zeitraffer-Bildgebungen zur Quantifizierung der organoiden Selbstmontage verwendet werden. Kulturübergreifend können Organoide und Konditionsmedium für histologische und Amino-Assay-Analysen gesammelt werden.
