עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המצוינות של מועצת המחקר האוסטרלית בהדמיה מולקולרית מתקדמת (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). מחקר זה נערך בחלקו באמצעות קרן MX2 ב Synchrotron האוסטרלי, חלק ANSTO, ועשה שימוש בגלאי הקרן האוסטרלית לחקר הסרטן (ACRF).

1. הכנת גבישים במדיה צמיגה גבוהה באמצעות מזרקי זכוכית
<ol><li>צנטריפוגה פתרון גביש בעדינות (~ 1,000 x גרם, ~ 10 דקות ב 22 מעלות צלזיוס) כדי ליצור גלולת גביש רך ולהסיר את החיץ עודף. זה יגרום ריכוז גבוה של גבישים גלולה אשר ניתן להשתמש בהם לאיסוף נתונים. הערה: כדי למנוע דילול של התקשורת הצמיגת להגדיל את ריכוז הגביש בשלב זה. לייעל את היחס בין מדיה צמיגה לנפח גביש עבור כל מדגם כדי לקבל ריכוז גבוה של גבישים תוך שמירה על צמיגות גבוהה עבור התקשורת. צנטריפוגה פתרון גביש כדי ליצור גלולה ולהסיר חיץ עודף כדי להגדיל את ריכוז הגביש בתמיסה, כמתואר Darmanin et. אל.29.</li>
	<li>הגדר שני מזרקים 100 μL עם מצמד.</li>
	<li>הדקו את המצמד לסוף המזרק הראשון והוסיפו 28 μL של תמיסת גביש לחלק העליון של המזרק. לאט, להכניס את הוכנה לתוך החלק העליון של המזרק בעדינות לדחוף את הפתרון עד הסוף של קצה מצמד, הסרת כל בועות אוויר היוצרים. עשה זאת על-ידי ביצוע אחת משתי השיטות הנדונים להלן. הערה: נפח הגבישים שיש להוסיף למדיה הצמיגית הגבוהה יכול להיות מגוון אם זה לא משנה באופן משמעותי את הצמיגות של המדגם הכולל.<ol>
<li>שיטה ראשונה: השתמש בשינויי לחץ מהירים כדי לפוצץ את בועות האוויר.<ol>
<li>מניחים בזהירות אצבע כפפה אחת על החלק העליון של נקודת מחט מצמד קהה (בעדינות רבה) להפעיל לחץ כדי ליצור חותם. אין להפעיל יותר מדי לחץ שכן הדבר עלול לגרום לפציעה במקל המחט.</li>
			<li>עכשיו למשוך את הבוכנה בחזרה כדי למשוך את הפתרון הרחק מנקודת המחט, זה ייצור הצטברות של לחץ במזרק.</li>
			<li>שחררו במהירות את הלחץ בחלק העליון של המזרק על ידי הסרת האצבע הכפפות מקצה המחט הקהה. היזהר, אם המדגם קרוב מדי לקצה כאשר האצבע מוסרת זה עלול לרסס החוצה וכתוצאה מכך אובדן מדגם. השינוי המהיר בלחץ בתוך המזרק יפוצץ את בועות האוויר. חזור על הפעולה עד להסרת כל הבועות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>שיטה שנייה: שימוש ב'צנטריפוגה האנושית' להסרת בועות אוויר.<ol>
<li>מניחים את המזרק ביד אחת עם המחט פונה כלפי מעלה ואת הבוכנה תקוע בין שתי אצבעות, כך שהוא לא יכול לזוז.</li>
			<li>לסובב במהירות את הזרוע מחזיקה את המזרק בכיוון אחד 2-3 פעמים, הכוח הצנטריפוגלי וכתוצאה מכך על המדגם יאלץ את כל בועות האוויר מתוך המזרק. היזהר, אם נעשה מדגם לאט מדי יכול ללכת לאיבוד.</li>
			<li>בדוק את המזרק עבור בועות אוויר, אם בועות להישאר, לחזור על שלבים 1.3.2.1 – 1.3.2.2 עד שכל בועות האוויר יוסרו.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>באמצעות מרית בסדר, להוסיף ~ 42 μL של שומן סיליקון ואקום גבוה ישירות לחלק העליון של המזרק השני. לדחוף את הוכנה כל הדרך עד הסוף, הסרת כל בועות האוויר ולהבטיח כי אין פער אוויר בסוף המזרק. הערה: ההרכב המדויק של גריז הסיליקון אינו קריטי כפי שהוא פועל כמוביל אינרטי. ערך צמיגות של >10 Pa.s או יחס של כ 60:40 גריז סיליקון לתמיסת גביש הוא אופטימלי להזרקה, עם זאת, זה אפשרי זה עשוי להשתנות בהתאם למאפיינים המדויקים של המדגם. כוונן את נפח תמיסת הגביש שנוספה לשמן הסיליקון כדי לייעל את ריכוז הגביש בתערובת, כמתואר בדיון. מדיה צמיגה גבוהה מלבד גריז סיליקון יכול לשמש כל עוד הם תואמים את המדגם30,31,32,33.</li>
	<li>ודא שאין בועות אוויר באחד משני המזרקים ולחבר את המזרקים יחד באמצעות המצמד. החזק את המזרקים אנכית על ידי אחיזה רק את סוף המזרק כמו חימום המזרק בשל החום שנוצר מאצבעות יכול להשפיע על המדגם.</li>
	<li>מערבבים את המדגם יחד על ידי מדכא בעדינות את הבוכנה בצד תמיסת הגביש, כך שהוא מתערבב לתוך גריז סיליקון ולאחר מכן לדחוף את הבוכנה בצד גריז סיליקון, כך שהוא דוחף את המדגם בחזרה לכיוון הצד פתרון גביש. בעדינות, לחזור על תהליך זה 50 עד 100 פעמים, כך המדגם מעורבב ביסודיות ונראה הומוגני. הערה: אם הגבישים גדלים ישירות במדיה צמיגה מאוד (למשל, שלב מעוקב שומני, LCP), שלבים 1.1–1.6 אינם נדרשים. פרוטוקולים לגידול גבישים בתוך המזרקים ניתן למצוא בליו et.al. 34,35. בצע פרוטוקול זה כדי לדגום איחוד, שלב 10, שבו כל המדגם כלול כעת במזרק אחד ומאגר ההתגבשות מוסר. התוספת של 7.9MAG אינה נדרשת עבור פרוטוקול זה. במקום זאת, להסיר את כל הנוזלים העודפים מן המזרק על ידי בעדינות דוחף את הוכנה למטה במדגם עד נוזל לא נשאר יותר במזרק.</li>
	<li>דמיינו את הגבישים תחת מיקרוסקופ אופטי או דרך המזרק או, לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לחלץ כמות קטנה (~ 1 μL) על מגלשת זכוכית ומניחים תלוש כיסוי על החלק העליון.</li>
	<li>בדוק ריכוז גביש.<ol>
<li>לקבוע את ריכוז הגביש בשמן הסיליקון על ידי ספירת מספר הגבישים באזור מסוים באמצעות תמונות מיקרוסקופ אופטי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, צפיפות גבוהה של גבישים מחולקת באופן אחיד בכל המדיה היא אידיאלית (>106 גבישים / מ"ל) על מנת להשיג שיעור פגיעת גביש גבוה.</li>
		<li>התאם את ריכוז הגביש במזרק על-ידי שינוי היחס בין גבישים למדיה צמיגה בשלבים 1.3 ו- 1.4.<ol>
<li>כדי להקטין את ריכוז הגבישים, לדלל את הגבישים במזרק על ידי הגדלת כמות גריז סיליקון / HV מדיה בשלב 1.4 או על ידי דילול גלולת הגביש בתמיסה עם חיץ התגבשות לפני הגדרת המזרקים בשלב 1.1.</li>
			<li>כדי להגדיל את ריכוז הגביש, להקטין את כמות גריז סיליקון בשלב 1.4 אבל להיות זהיר לא להפחית את הצמיגות מתחת 10 Pa.s. הערה: ריכוז הגביש שדווח כאן היה מותאם עבור מדגם ספציפי זה וגודל גביש. עם זאת, ריכוז הגביש האידיאלי יהיה תלוי בגודל הגביש, גודל הקרן, המחט קוטר פנימי (I.D.), ואת שטף רנטגן האירוע. זה יכול להיקבע משיעור הלהיט עם שיעור פגיעה אופטימלי של ~ 30% נחשב 'טוב'. בפועל, ריכוז הגביש חייב להיות מותאם לדגימות שונות במהלך זמן הקרן כדי להשיג את קצב הפגיעה הרצוי. התחל עם ריכוז גבוה של גבישים, 109 גבישים / מ"ל. ההליך להתאמת ריכוז הגביש ניתן בליו et.al. שלושים ו-35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן עד שהמזרק יהיה מוכן לאיסוף נתונים.<ol>
<li>אם הגבישים גדלים LCP, ואז לאטום אותם ולתת להם להישאר במזרקים עד כמה ימים בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>אם הגבישים הועברו למדיה צמיגה גבוהה אחרת (למשל, גריז סיליקון), אז בדיקת יציבות של הגבישים לאורך זמן צריך להתבצע לפני המדידה. פעולה זו תקבע כמה זמן הקריסטלים יציבים במדיה האינרטית (באופן אידיאלי > 8 שעות) ואת מגבלת הזמן לאיסוף נתונים. כאן, גבישי lysozyme היו יציבים במשך ימים בשומן סיליקון ולא הראו סימנים של המסה כאשר נבדק באמצעות מיקרוסקופ אופטי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>מעבירים את כל הדגימה למזרק אחד לפני ניתוק המצמד. נתק את המצמד מהמזרק וחבר את מחט ההזרקה. בורג המחט בחוזקה לתוך הבסיס של המזרק ולהבטיח כי הוא מהודק בחוזקה כדי למנוע דליפות. 108 מיקרומטר I.D. מחט (אורך מחט 13 מ"מ, סגנון נקודה 3) שימש לניסוי זה. בהתאם לגודל הגביש וגודל הקרן לצרף גם 51 מיקרומטר או 108 μm I.D. מחט. הערה: בדיקה מוקדמת של זרם המדגם לפני זמן הקרן נדרשת כדי להיות מסוגל לבחור את גודל מחט המזרק הנכון. בהתאם למאפייני המדגם (כלומר, צמיגות, טעינה, הרכב חיץ) ותודעת המחט, הדגימות יזרמו באופן שונה. לכן, מומלץ לבדוק מגוון גדלי מחטים כדי לייצר את הזרם היציב ביותר עם המחט הקטנה ביותר האפשרית לתקליטור כדי למקסם את יחס האות לרעש במהלך איסוף הנתונים.</li>
	<li>אם המזרק כבר נטען ומיושר על קו הקרן לעבור לסעיף 3 ולהרכיב את המזרק מדגם ישירות על המזרק. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>2. הרכבה ובקרה של מזרק
<ol><li>תרכיב את המזרק על קו הקורה. הסר את הזרבובית הקריוגנית על קו הקורה MX2 והחליף אותו במזרק. שחררו את בורג ההידוק שמחזיק את הזרבובית הקריוגנית וחברו אותה למסגרת הממוקמת בסמוך לשלב הממונע.</li>
	<li>הרם את המזרק מהעגלה שלו על ידי החזקת הידית השחורה והנח אותו על הבמה הממונעת.<ol>
<li>כדי להדק את המזרק לשלב הממונע; היד להדק את ידית בורג הידוק שחור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הר מזרק ריק על המזרק<ol>
<li>בממשק בקרת המחשב מזרק (כלומר, תוכנת בקרת מיקום EPOS), בחר מצב ביות תחת כלים בתפריט התוכנה. לאחר מכן בחרו 'מתג הגבלה שלילית' והתחילו להתביית, תנו לתוכנה לפעול עד שהבורג יתבטל מספיק כדי שהמזרק יתאים מתחת לבורג. אם נותר להפעיל ללא השגחה מתג המגבלה עוצר את הבורג באופן אוטומטי.</li>
		<li>הר מזרק ריק ('דמה') על המזרק על ידי החדרת המחט דרך החריץ במחזיק המזרק. תיישר את המזרק כנגד הסוגר.</li>
		<li>הדק את המזרק עם שתי אורינגים.<ol>
<li>לעטוף את O-ring הראשון על פני החלק האמצעי של המזרק חיבור אותו ווים משני צדי המזרק.</li>
			<li>לולאה O-ring השני סביב הקרסים בחלק העליון של המזרק ולאחר מכן לשים חלק אחד של O-ring על החלק העליון של מזרק זכוכית כפי שמוצג בהדגמה איור 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>יישור המזרק לקרן רנטגן<ol>
<li>הזז את השלב הממונע עם המזרק לכיוון נקודת האינטראקציה של קרני הרנטגן באמצעות תוכנת הבקרה של קו הקרן. ניתן לדמיין זאת באמצעות המצלמה בתוך השורה. הגודל והמיקום של הקרן מסומנים על ידי צלב אדום על המסך ואת השלב הממונע ניתן להזיז כדי ליישר את המחט עם אזור אינטראקציית רנטגן.</li>
		<li>להתאים את המיקום x ו- y של הבמה כדי ליישר את המחט עם הצלב האדום.</li>
		<li>כוונן את תנוחת z עד קצה המחט נכנס לפוקוס.</li>
		<li>ודא יישור של קצה המחט וקרן רנטגן חזותית על ידי בדיקה כי קצה המזרק פוגש את הכוונת אשר גלויים בתמונה מיקרוסקופ אופטי שנוצר על ידי המצלמה קרן.</li>
		<li>לאחר קצה המחט מיושר להזיז את הקצה מעל שערות הצלב ~ 100 מיקרומטר. זה מבטל פיזור רנטגן מקצה המחט. הערה: הרכבה ויישור של המזרק על קו הקורה MX2 בסנכרון חייב להתבצע על ידי מדעני קו הקרן וניתן להשלים אותו תוך פחות מ-30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הרכבה של מזרק המדגם
<ol><li>החלף את המזרק הריק במזרק לדוגמה על-ידי ביצוע שלב 2.3.</li>
	<li>מניחים את מכסה המזרק על ראש בוכנה מזרק מדגם.</li>
	<li>הזז את בורג הכונן לחלק העליון של המכסה.</li>
	<li>בתוכנת בקרת המזרק בחר מצב מהירות.</li>
	<li>קלט 3000 סל"ד (~ 115 nL/s) כערך ההגדרה והקשה על החל ערך הגדרה.</li>
	<li>כאשר בורג הכונן נוגע בכובע על ראש הכועסה המזרק, לעצור את המנוע.<ol>
<li>הגדר את ערך הסל"ד לאפס בתוכנת בקרת המזרק על-ידי שינוי ערך ההגדרה ל- '0' כאשר הבורג מתקרב למכסה.</li>
		<li>לאחר יצירת מגע, הפעל את הערך המוגדר מראש על-ידי הקשה על החל הגדרת ערך כדי לעצור את הבורג באופן מיידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעדינות לנענע את הכובע כדי לוודא שהוא מוחזק בחוזקה במקום. הערה: בכל פעם שמוזנים ערך ערכה חדש בתיבה הגדרת ערך בתוכנת הבקרה הוא מופעל רק לאחר הקשה על החל ערך הגדרה.</li>
</ol>4. הפעלת המזרק
<ol><li>לאחר בורג כונן כובע יצר קשר איתן עם החלק העליון של הכוכנה לשנות את סל"ד הגדרת ערך ל 100. זה שווה ערך ~ 4 nL / s.</li>
	<li>ויזואלית לבדוק את קצה המחט כאשר המדגם הראשון יוצא או להסתכל על תמונת המצלמה beamline של המחט להתבונן כאשר המדגם מתחיל להבליט מקצה המחט.</li>
	<li>לבצע חיפוש של האץ', לסגור את דלת האץ', ולהדליק את קרן הרנטגן. מנקודה זו יש להפעיל את המזרק מרחוק מחוץ לאצרף.</li>
	<li>כוונן את הסל"ד עד להיווצרות זרם יציב.<ol>
<li>הקטן את ערך הגדרת הסל"ד ל- 90.</li>
		<li>חזור על שלב 4.4.1, הפחתת ערך הגדרת סל"ד במרווחים של 10, כדי להאט את הזרם אך עדיין לשמור על זרם יציב. עבור גריז סיליקון נעשה שימוש בערך של 30 סל"ד. הערה: טווח הסל"ד הטיפוסי נע בין 30 ל-100 סל"ד (1 - 4 nL/s) בהתאם למאפייני הדגימה ולזמן החשיפה לרנטגן. באופן כללי, יש לכוונן את הסל"ד כדי לייצר את קצב הזרימה האיטי ביותר (כדי למזער את צריכת הדגימה) תוך שמירה על זרם יציב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניהול זרם לדוגמה שאינו זורם היטב.<ol>
<li>המשך להגדיל את ערך הגדרת הסל"ד במרווחים של 10 עד שהזרם יתיישר. אם הזרם אינו מתייצב, גם לאחר הגדלת ערך הגדרת הסל"ד לערך המרבי של 100 סל"ד נסה לשפר את היציבות על-ידי יישום אחת משתי השיטות המתוארות להלן.<ol>
<li>שיטה ראשונה: הוסף לוכד מדגם פוליסטירן מתחת לזרם לדוגמה כדי לסייע בהנחיית הדגימה. שיטה זו פועלת היטב עבור זרמי מדגם טעונים מאוד.</li>
			<li>שיטה שנייה: הכנס משפך יניקה venturi לתופס מדגם. כדי לספק אוויר למשפך, חבר אותו לצינור שקע האוויר הממוקם בצריף. שיטה זו יכולה לסייע בהכוונה ובייצוב זרימת הדגימה ללא תלות במטען הנחל.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר שיושג זרם קבוע ויציב, התחל איסוף נתונים ומטב את מרחק הגלאי לפי ניסוי קריסטלוגרפיה רגיל של קרני רנטגן. הערה: הסל"ד מומר לקצב זרימה באמצעות טבלת ההמרות שסופקה במידע המשלים, 'מחשבון ההתקנים של Lipidico'. הזן את ערך הסל"ד, קטרי המחט ונפחי המזרק כדי לחשב את קצב הזרימה באמצעות מחשבון זה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boutet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+protein+structure+determination+by+serial+femtosecond+crystallography.">High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography.</a> Science. 337 (6092), 362-364 (2012).</li><li>Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+lasers+for+structural+and+dynamic+biology.">X-ray lasers for structural and dynamic biology.</a> Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).</li><li>Aquila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+protein+nanocrystallography+using+an+X-ray+free-electron+laser.">Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser.</a> Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nylon+mesh-based+sample+holder+for+fixed-target+serial+femtosecond+crystallography.">Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 9, 6971 (2019).</li><li>Martin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+X-ray+diffraction+reveals+three-dimensional+nanostructure+and+disorder+in+self-assembled+lipid+phases.">Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases.</a> Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).</li><li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+fixed-target+serial+virus+crystallography.">High-speed fixed-target serial virus crystallography.</a> Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).</li><li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography.">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nature Communications. 5, 3309 (2014).</li><li>Weierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography.">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser.">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li><li>Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+delivery+media+for+serial+crystallography.">Sample delivery media for serial crystallography.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).</li><li>Batyuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+phasing+of+x-ray+free-electron+laser+data+for+a+G+protein-coupled+receptor.">Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor.</a> Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).</li><li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+intermediates+of+Kok's+photosynthetic+water+oxidation+clock.">Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock.</a> Nature. 563 (7731), 421 (2018).</li><li>Suga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxyl/oxo+mechanism+for+oxygen-oxygen+coupling+in+PSII+revealed+by+an+x-ray+free-electron+laser.">An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser.</a> Science. 366 (6463), 334-338 (2019).</li><li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein.">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li><li>Pande, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+structural+dynamics+drives+the+trans/cis+isomerization+in+photoactive+yellow+protein.">Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein.</a> Science. 352 (6286), 725-729 (2016).</li><li>Ishigami, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshot+of+an+oxygen+intermediate+in+the+catalytic+reaction+of+cytochrome+c+oxidase.">Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).</li><li>Nango, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+movie+of+structural+changes+in+bacteriorhodopsin.">A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin.</a> Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+isomerization+in+bacteriorhodopsin+captured+by+a+femtosecond+x-ray+laser.">Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser.</a> Science. 361 (6398), (2018).</li><li>Martin-Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+millisecond+crystallography+of+membrane+and+soluble+protein+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).</li><li>Berntsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+millisecond+crystallography+instrument+at+the+Australian+Synchrotron+incorporating+the+"Lipidico"+injector.">The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector.</a> Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).</li><li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams.">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).</li><li>DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N., Tschentscher, T., Cocco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+injection+for+pulsed+X-ray+sources.">Sample injection for pulsed X-ray sources.</a> Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. , 8078 (2011).</li><li>Park, S. Y., Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+delivery+using+viscous+media,+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography.">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li><li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure.">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li><li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography.">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li><li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography.">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345 (2016).</li><li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography.">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography.">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484 (2016).</li><li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase.">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li><li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography.">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).</li><li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography.">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li><li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography.">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li><li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science:+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art.">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li></ol>

ח"כ עובד עבור עיצובי Kusel. Kusel Design, מפתחת מכשיר מעבדה מותאמת אישית, הייתה מאורסת על ידי ד"ר פיטר בנסן מאוניברסיטת לה טרובה וד"ר טום קרדוק-דייויס מ- ANSTO ולפתח מכשיר בעלות נמוכה כדי לאפשר מחקרים צמיגים גבוהים בקו קרן MX2 בסינכרוטרון האוסטרלי. המכשיר פותח בהתייעצות הדוקה עם ד"ר קרדוק-דייויס. למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

HVI חלופי פותח, אידיאלי לביצוע ניסויי SX במקורות synchrotron. יש לו שני יתרונות מרכזיים על פני HVIs קיימים. ראשית, קל להתקין על קו הקרן המאפשר מעבר מהיר בין קריסטלוגרפיה קונבנציונלית SX, רק ~ 30 דקות נדרש להתקנה ויישור על MX2. שנית, מזרקי המדגם המשמשים לגידול גבישים יכולים לשמש ישירות כמאגרים להזרקה, הגבל?...

קריסטלוגרפיה סדרתית (SX) היא טכניקה שפותחה בתחילה בהקשר של לייזרים אלקטרונים ללא קרני רנטגן (XFELs)1,2,3,4. למרות גישות היעד קבוע יכול לשמש SX5,6,7, בדרך כלל, מערכות מזרק משמשים כדי לספק גבישים בזרם רציף לקרן הרנטגן. מכיוון שהוא משלב נתונים ממספר רב של גבישים, SX נמנע מהצורך ביישור גביש במהלך הניסוי, ומאפשר איסוף נתונים בטמפרטורת החדר8,9. בעזרת מזרק מתאים, הגבישים מוזרמים בזה אחר זה לאזור האינטראקציה של קרני הרנטגן ונתוני עקיפה וכתוצאה מכך נאספים על גלאי אזור9,10. עד כה, SX הצליחה לפתור מספר מבני חלבון1,11,12,13 כולל גבישים קטנים מכדי למדוד באמצעות קריסטלוגרפיה קונבנציונלית. היא גם סיפקה תובנות חדשות על הדינמיקה המולקולרית שנפתרה בזמן על ידי ניצול משך הדופק femtosecond של XFEL. על ידי ייזום תגובות משאבה בדיקה עם מקורות לייזר אופטיים, מחקרים מעמיקים בוצעו על פוטוסיסטם II14,15, חלבון צהוב פוטואקטיבי16,17, ציטוכרום C אוקסידאז18, כמו גם בקטריאורהודופסין19,20,21. מחקרים אלה בדקו את הדינמיקה של העברת אלקטרונים המתרחשת בעקבות הפעלת אור המדגימה את הפוטנציאל המשמעותי של קריסטלוגרפיה סדרתית להבנת תהליכים ביולוגיים שנפתרו בזמן.
פיתוח של קריסטלוגרפיה סדרתית הוא גם הופך נפוץ יותר ויותר במקורות synchrotron9,12,20,22,23,24. SX מבוסס Synchrotron מאפשר למספר גדול של גבישים בודדים להימדד ביעילות בטמפרטורת החדר באמצעות מערכת מזרק מתאימה. גישה זו מתאימה גבישים קטנים יותר ומכאן, בנוסף לדרוש גלאי קצב מסגרות מהיר כדי לאסוף את הנתונים, קרן מיקרו ממוקדת נדרשת גם. בהשוואה לקריסטלוגרפיה קונבנציונלית, SX אינו כרוך בהרכבה ויישור של גבישים בודדים בקרן הרנטגן. מכיוון שנתונים ממספר רב של גבישים בודדים ממוזגים, ניתן להפחית באופן משמעותי את מינון הקרינה המתקבל על ידי כל גביש בהשוואה לקריסטלוגרפיה קונבנציונלית. ניתן להחיל את Synchrotron SX גם על חקר התגובות שנפתרו בזמן, אפילו עד למשטר אלפיות השניה, בתנאי שגלאי עם קצב מסגרות גבוה מספיק זמין (למשל, 100 הרץ או יותר). מספר ניסויים קריסטלוגרפיים סדרתיים בוצעו בסנכרון באמצעות מזרקים שפותחו בתחילה במקורות XFEL20,22,23. שני הסוגים הנפוצים ביותר של מזרק הם זרבובית וירטואלית דינמי גז (GDVN)25 מזרק צמיג גבוה (HVI)9,24,26,27,28. GDVN הוא אידיאלי להזרקת צמיגות נמוכה, דגימות נוזליות, אבל דורש שיעורי זרימה גבוהים כדי להשיג זרמים יציבים, אשר בתורו מוביל לשיעורי צריכת מדגם גבוהים. לעומת זאת, HVI's מתאימים לדגימות צמיגות גבוהות המאפשרות יצירת זרם יציב בקצב זרימה נמוך בהרבה, מה שמוביל לצריכת מדגם נמוכה בהרבה. מזרק HVI, אם כן, מעדיף משלוח של דגימות שבו נשא צמיג עדיף (למשל, שומנים מבוססי חלבונים קרום) ו / או כמויות גדולות של מדגם אינם זמינים. מזרקי SX הם בדרך כלל מאתגרים לשימוש ודורשים הכשרה נרחבת כדי לפעול. הם כוללים גם פרוטוקולי העברה מדגם ארוכים, כמו המדגם צריך להיות טעון לתוך מאגר מיוחד, זה בדרך כלל יש סיכון גבוה הקשורים אליו של מדגם הולך לאיבוד או "נפח מת" או באמצעות דליפות בחיבורים. לכן, רצוי לייעל את עיצוב המזרק כדי למתן את כל ההפסדים לפני המדגם להגיע קרן רנטגן.
לאחרונה, תוצאות SX הראשון פורסמו באמצעות Lipidico23 עם יעד lysozyme, באמצעות גלאי Eiger 16M. עיצוב מזרק זה מגביל את בזבוז הדגימה על ידי מזעור מספר השלבים המעורבים במעבר מהתגבשות ראשונית להעברת גבישים למזרק ואחריו מסירת דגימה לקרן הרנטגן. כתב יד זה מתאר ומדגים את הליך ההעברה לדוגמה החל מהכנת מדגם, מעבר לתהליך ההזרקה, ולבסוף איסוף נתונים, באמצעות אותו כלי התגבשות. הפעולה של המזרק מתוארת גם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hen eggwhite lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicon grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector needle (108 &#181;m ID)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part No: 7803-05</td>
			<td>www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas-tight syringes, 100 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part no: 7656-01</td>
			<td>Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCP syringe coupler</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>209526</td>
			<td>Syringe coupler to mix the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidico injector</td>
			<td>La Trobe Univerity/ANSTO</td>
			<td></td>
			<td>This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron

מתקן לביצוע מדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות פותח בסנכרון האוסטרלי. מתקן זה משלב מזרק צמיג גבוה שנבנה למטרה, Lipidico, כחלק מקו הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית (MX2) למדידת מספר גדול של גבישים קטנים בטמפרטורת החדר. מטרת טכניקה זו היא לאפשר גידול/העברה של גבישים למזרקי זכוכית ישירות במזרק לאיסוף נתונים קריסטלוגרפיה סדרתית. היתרונות של מזרק זה כוללים את היכולת להגיב במהירות לשינויים בקצב הזרימה ללא הפרעה של הזרם. קיימות מספר מגבלות עבור מזרק צמיגות גבוה זה (HVI) הכוללות הגבלה על צמיגות הדגימה המותרת ל- >10 Pa.s. יציבות זרם יכולה גם להיות בעיה בהתאם למאפיינים הספציפיים של המדגם. פרוטוקול מפורט כיצד להגדיר דגימות ולהפעיל את המזרק למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי מוצג כאן. השיטה מדגימה הכנת המדגם, כולל העברת גבישי lysozyme לתוך מדיה צמיגה גבוהה (גריז סיליקון), ואת הפעולה של המזרק לאיסוף נתונים ב MX2.

ליפידיקו היא HVI שנבנתה כמערכת משלוחים חלופית לשימוש ב-MX2 (איור 1). הוא מתאים באופן אידיאלי עבור SX שבו גבישים גדלים או בשלב מעוקב השומנים או מועברים למדיה אינרטית צמיג גבוהה.
כדי להדגים את יישום מזרק גריז סיליקון מעורבב עם גבישי lysozyme שימש כדי לאסוף נתוני SX בקו ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron at JoVE.com

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להכין דגימות קריסטלוגרפיה סדרתיות לאיסוף נתונים על מזרק צמיג גבוה, Lipidico, שהוזמן לאחרונה בסנכרון האוסטרלי.

פרוטוקול הזרקת ליפידיקו למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.2K Views.  La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להכין דגימות קריסטלוגרפיה סדרתיות לאיסוף נתונים על מזרק צמיג גבוה, Lipidico, שהוזמן לאחרונה בסנכרון האוסטרלי.

Video: Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

סינתזה של הידרוג עם מאפייני Antifouling ופלטות לטיהור מים

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

מידות קלט כוח ריאקטורים מנוער בקנה מידה מעבדה

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

ננו-חלקיק Retroductal הזרקה אל בלוטת Submandibular מאתר

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

מערכת הזרמה אוטומטית לעיבוד תאים בקנה מידה קטן

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized matrix. This organization is challenging to replicate due to the heterogeneous environment of bone. Ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions (COBICS) is a microgel-based bioprinting technique that uniquely replicates the mineral and cellular structure of bone. COBICS prints complex, biologically relevant constructs without the need for sacrificial support materials or harsh postprocessing steps (e.g., radiation and high-temperature sintering), which are two of the biggest challenges in the additive manufacturing of bone mimetic constructs. This technique is enabled via the freeform extrusion of a novel calcium phosphate-based ink within a gelatin-based microgel suspension. The yield-stress properties of the suspension allow deposition and support the printed bone structure. UV crosslinking and nanoprecipitation then "lock" it in place. The ability to print nanostructured bone-mimetic ceramics within cell-laden biomaterials provides spatiotemporal control over macro- and micro-architecture and facilitates the real-time fabrication of complex bone constructs in clinical settings.

This protocol describes a 3D printing technique to fabricate bone-like structures by depositing a calcium phosphate ink in a gelatin-based granular support. Printed bone analogs are deposited in freeform, with flexibility for direct harvesting of the print or crosslinking within a living cell matrix for multiphasic constructs.

הדפסה ביולוגית רב-כיוונית קרמית במתלים עמוסי תאים ליצירת אנלוגים לעצם

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a chemotherapeutic might be functionalized with an antibody to enhance binding to cancer cells (&#34;targeting&#34;) or functionalized with polyethylene glycol to help evade immune cell recognition (&#34;stealth&#34;). Even at a cellular level, optimizing the binding and uptake of a drug carrier is a complex biological design problem. Thus, it is valuable to separate how strongly a new carrier interacts with a cell from the functional efficacy of a carrier&#39;s cargo once delivered to that cell.
To continue the chemotherapeutic example, &#34;how well it binds to a cancer cell&#34; is a separate problem from &#34;how well it kills a cancer cell&#34;. Quantitative in vitro assays for the latter are well established and usually rely on measuring viability. However, most published research on cell-carrier interactions is qualitative or semiquantitative. Generally, these measurements rely on fluorescent labeling of the carrier and, consequently, report interactions with cells in relative or arbitrary units. However, this work can be standardized and be made absolutely quantitative with a small number of characterization experiments. Such absolute quantification is valuable, as it facilitates rational, inter- and intra-class comparisons of various drug delivery systems-nanoparticles, microparticles, viruses, antibody-drug conjugates, engineered therapeutic cells, or extracellular vesicles.
Furthermore, quantification is a prerequisite for subsequent meta-analyses or in silico modeling approaches. In this article, video guides, as well as a decision tree for how to achieve in vitro quantification for carrier drug delivery systems, are presented, which take into account differences in carrier size and labeling modality. Additionally, further considerations for the quantitative assessment of advanced drug delivery systems are discussed. This is intended to serve as a valuable resource to improve rational evaluation and design for the next generation of medicine.

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A workflow is demonstrated for the absolute quantification of drug carrier-cell interactions using flow cytometry to allow better rational evaluation of novel drug delivery systems. This workflow is applicable to drug carriers of any type.

כימות ניסיוני של אינטראקציות בין מערכות העברת תרופות ותאים במבחנה: מדריך להערכת ננו-רפואה פרה-קלינית

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

שיטת הזרקה איטית זעיר פולשנית חדשנית להפחתת פגיעה ברקמות

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

מחבר זרקור: שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...