Ces travaux ont été appuyés par l’Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Cette recherche a été entreprise en partie à l’aide de la ligne de faisceau MX2 au synchrotron australien, qui fait partie de l’ANSTO, et a fait usage du détecteur de l’Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

1. Préparation de cristaux dans un média visqueux élevé à l’aide de seringues en verre
<ol><li>Centrifugeuse la solution cristalline doucement (~1.000 x g,~10 min à 22 °C) pour former une pastille en cristal souple et enlever l’excès de tampon. Il en résultera une forte concentration de cristaux dans la pastille qui peut être utilisée pour la collecte de données. REMARQUE : Pour éviter la dilution du média visqueux augmenter la concentration de cristal à cette étape. Optimisez le rapport entre les supports visqueux et le volume cristallin pour chaque échantillon afin d’obtenir une forte concentration de cristaux tout en conservant une viscosité élevée pour les supports. Centrifugeuse la solution cristalline pour former une pastille et enlever l’excès de tampon pour augmenter la concentration de cristal dans la solution, comme décrit dans Darmanin et. al.29.</li>
	<li>Installez deux seringues de 100 μL avec un coupler.</li>
	<li>Attachez le coupler à l’extrémité de la première seringue et ajoutez 28 μL de solution cristalline au sommet de la seringue. Lentement, insérez le piston dans le haut de la seringue et poussez doucement la solution vers le bas à l’extrémité de la pointe du coupler, en enlevant toutes les bulles d’air qui se forment. Faites ceci en suivant l’une des deux méthodes discutées ci-dessous. REMARQUE : Le volume de cristaux à ajouter aux supports visqueux élevés peut être varié s’il ne modifie pas significativement la viscosité de l’échantillon global.<ol>
<li>Première méthode : Utilisez des changements de pression rapides pour faire éclater les bulles d’air.<ol>
<li>Placez soigneusement un doigt ganté sur le dessus du point d’aiguille du coupler émoussé et appliquez (très doucement) une pression pour créer un joint. N’appliquez pas trop de pression car cela peut entraîner une blessure par piqûre d’aiguille.</li>
			<li>Maintenant, tirez le piston en arrière pour tirer la solution loin du point d’aiguille, cela va générer une accumulation de pression dans la seringue.</li>
			<li>Relâchez rapidement la pression en haut de la seringue en enlevant le doigt ganté de la pointe émoussée de l’aiguille. Soyez prudent, si l’échantillon est trop près de la pointe lorsque le doigt est enlevé, il peut pulvériser entraînant la perte d’échantillon. Le changement rapide de pression à l’intérieur de la seringue fera éclater les bulles d’air. Répétez l’année jusqu’à ce que toutes les bulles aient été enlevées.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deuxième méthode : Utiliser la « centrifugeuse humaine » pour éliminer les bulles d’air.<ol>
<li>Placez la seringue dans une main avec l’aiguille orientée vers le haut et le piston coincé entre deux doigts, de sorte qu’il ne peut pas bouger.</li>
			<li>Faites pivoter rapidement le bras en tenant la seringue dans une direction 2 à 3 fois, la force centrifuge résultante sur l’échantillon forcera toutes les bulles d’air hors de la seringue. Soyez prudent, si fait trop lentement échantillon peut être perdu.</li>
			<li>Inspectez la seringue pour déceiller les bulles d’air, si des bulles demeurent, répétez les étapes 1.3.2.1 – 1.3.2.2 jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient enlevées.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>À l’aide d’une spatule fine, ajouter environ 42 μL de graisse de silicone sous vide élevée directement sur le dessus de la deuxième seringue. Poussez le piston jusqu’à la fin, en enlevant toutes les bulles d’air et en veillant à ce qu’il n’y ait pas de trou d’air au bout de la seringue. REMARQUE : La composition précise de la graisse de silicone n’est pas critique car elle agit comme un transporteur inerte. Une valeur de viscosité de >10 Pa.s ou un rapport d’environ 60:40 graisse de silicone à la solution cristalline est optimale pour l’injection, cependant, il est possible que cela puisse varier en fonction des caractéristiques exactes de l’échantillon. Ajustez le volume de solution cristalline ajouté à la graisse de silicone pour optimiser la concentration de cristaux dans le mélange, comme indiqué dans la discussion. Les supports à visqueux autres que la graisse de silicone peuvent être utilisés tant qu’ils sont compatibles avecl’échantillon 30,31,32,33.</li>
	<li>Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans l’une ou l’autre des deux seringues et attachez les seringues ensemble à l’aide du coupler. Tenez les seringues verticalement en griping juste l’extrémité de la seringue pendant que réchauffer la seringue due à la chaleur produite des doigts peut affecter l’échantillon.</li>
	<li>Mélanger l’échantillon en déprimant doucement le piston du côté de la solution cristalline afin qu’il se mélange à la graisse de silicone, puis pousser le piston sur le côté graisse de silicone, de sorte qu’il pousse l’échantillon vers le côté solution cristalline. Doucement, répétez ce processus 50 à 100 fois afin que l’échantillon soit mélangé à fond et semblehomogène. REMARQUE : Si les cristaux sont cultivés directement dans des supports très visqueux (p. ex., phase cubique lipidique, LCP), les étapes 1.1-1.6 ne sont pas nécessaires. Des protocoles pour la culture des cristaux dans les seringues peuvent être trouvés dans Liu et.al. 34,35. Suivez ce protocole jusqu’à la consolidation de l’échantillon, étape 10, où tout l’échantillon est maintenant contenu dans une seringue et le tampon de cristallisation est supprimé. L’ajout de 7.9MAG n’est pas nécessaire pour ce protocole. Au lieu de cela, retirez tout excès de liquide de la seringue en poussant doucement le piston vers le bas dans l’échantillon jusqu’à ce qu’il ne reste plus de liquide dans la seringue.</li>
	<li>Visualisez les cristaux au microscope optique soit à travers la seringue, soit, pour de meilleurs résultats, extrayez une petite quantité (~1 μL) sur une lame de verre et placez un glissement de couverture sur le dessus.</li>
	<li>Vérifiez la concentration de cristaux.<ol>
<li>Déterminez la concentration de cristaux dans la graisse de silicone en comptant le nombre de cristaux dans une zone spécifique à l’aide des images au microscope optique. Pour de meilleurs résultats, une forte densité de cristaux uniformément distribués dans les médias est idéale (>106 cristaux/mL) afin d’obtenir un taux élevé de cristal-frappé.</li>
		<li>Ajustez la concentration de cristaux dans la seringue en modifiant le rapport cristaux/supports visqueux dans les étapes 1.3 et 1.4.<ol>
<li>Pour diminuer la concentration en cristaux, diluer les cristaux dans la seringue en augmentant la quantité de graisse de silicone/HV à l’étape 1.4 ou en diluant la pastille de cristal en solution avec le tampon de cristallisation avant de mettre en place les seringues à l’étape 1.1.</li>
			<li>Pour augmenter la concentration en cristal, diminuer la quantité de graisse de silicone à l’étape 1.4, mais n’oubliez pas de ne pas réduire la viscosité en dessous de 10 Pa.s. REMARQUE : La concentration de cristaux signalée ici a été optimisée pour cet échantillon spécifique et la taille du cristal. Toutefois, la concentration de cristal idéale dépendra de la taille du cristal, de la taille du faisceau, du diamètre interne de l’aiguille (D.I.) et du flux de rayons X incident. Cela peut être déterminé à partir du taux de réussite avec un taux de réussite optimal d’environ 30% considéré comme « bon ». Dans la pratique, la concentration en cristaux doit être optimisée pour différents échantillons pendant le temps de faisceau pour obtenir le taux de frappe désiré. Commencez par une forte concentration de cristaux, 109 cristaux/mL. La procédure d’ajustement de la concentration en cristal est donnée dans Liu et.al. 35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Le protocole peut être mis en pause ici jusqu’à ce que l’injecteur soit prêt pour la collecte de données.<ol>
<li>Si les cristaux sont cultivés en LCP, scellez-les et laissez-les rester dans des seringues jusqu’à quelques jours à température ambiante.</li>
			<li>Si les cristaux ont été transférés dans un autre média visqueux élevé (p. ex., la graisse de silicone), un test de stabilité des cristaux au fil du temps devrait être effectué avant la mesure. Cela déterminera combien de temps les cristaux sont stables dans le média inerte (idéalement > 8 h) et le délai pour la collecte de données. Ici, les cristaux de lysozyme ont été stables pendant des jours dans la graisse de silicone et n’ont pas montré de signes de dissolution lorsqu’ils ont été inspectés à l’aide d’un microscope optique.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Déplacez tout l’échantillon dans une seringue avant de débrancher le coupler. Déconnecter le coupler de la seringue et fixer l’aiguille d’injection. Vissez fermement l’aiguille dans la base de la seringue et assurez-vous qu’elle est bien attachée pour éviter toute fuite. Une aiguille i.D. de 108 μm (longueur d’aiguille de 13 mm, style point 3) a été utilisée pour cette expérience. Selon la taille du cristal et la taille du faisceau, fixez une aiguille d’I.D. de 51 μm ou de 108 μm. REMARQUE : Le pré-test du flux d’échantillons avant l’heure du faisceau est nécessaire pour être en mesure de sélectionner la taille correcte de l’aiguille injecteur. Selon les caractéristiques de l’échantillon (c.-à-vis de la viscosité, de la charge, de la composition tampon) et de l’i.D. de l’aiguille, les échantillons circuleront différemment. Par conséquent, il est recommandé de tester une variété de tailles d’aiguilles pour produire le flux le plus stable avec la plus petite aiguille d’i.d. possible afin de maximiser le rapport signal-bruit lors de la collecte de données.</li>
	<li>Si l’injecteur est déjà monté et aligné sur la ligne de faisceau, déplacez-vous vers la section 3 et montez la seringue de l’échantillon directement sur l’injecteur. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
</ol>2. Montage et contrôle d’injecteur
<ol><li>Montez l’injecteur sur la ligne de faisceau. Retirez la buse cryogénique sur la ligne de faisceau MX2 et remplacez-la par l’injecteur. Desserrez la vis de serrage qui maintient la buse cryogénique et fixez-la au support situé à côté de la scène motorisée.</li>
	<li>Soulevez l’injecteur de son chariot en tenant la poignée noire et placez-la sur la scène motorisée.<ol>
<li>Attacher l’injecteur au stade motorisé; main serrer le bouton de vis à serrant noir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter une seringue vide sur l’injecteur<ol>
<li>Dans l’interface de contrôle informatique injecteur (c.-à-d. le logiciel de contrôle de position EPOS), sélectionnez le mode Homing sous outils dans le menu logiciel. Ensuite, sélectionnez Commutateur limite négative, et Démarrer Homing, laissez le logiciel s’exécuter jusqu’à ce que la vis est rétractée suffisamment pour la seringue pour s’adapter sous la vis. S’il n’est pas surveillé, l’interrupteur limite arrête automatiquement la vis.</li>
		<li>Montez une seringue vide (« factice ») sur l’injecteur en insérant l’aiguille à travers la fente dans le porte-seringue. Alignez la seringue contre le support.</li>
		<li>Attachez la seringue avec deux anneaux O.<ol>
<li>Enroulez le premier anneau O sur la partie médiane de la seringue en l’attachant aux crochets de chaque côté de la seringue.</li>
			<li>Bouclez le deuxième anneau O autour des crochets sur la partie supérieure de la seringue, puis placez une partie de l’anneau O sur le dessus de la seringue en verre comme le montrent la démonstration et la figure 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aligner l’injecteur sur le faisceau de rayons X<ol>
<li>Déplacez l’étape motorisée avec l’injecteur vers le point d’interaction aux rayons X via le logiciel de commande de la ligne de faisceau. Cela peut être visualisé à l’aide de la caméra en ligne. La taille et la position du faisceau sont indiquées par une croix rouge sur l’écran et le stade motorisé peut être déplacé pour aligner l’aiguille avec la région d’interaction aux rayons X.</li>
		<li>Ajustez la position x et y de la scène pour aligner l’aiguille avec la croix rouge.</li>
		<li>Ajustez la position z jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit mise au point.</li>
		<li>Vérifiez visuellement l’alignement de la pointe de l’aiguille et du faisceau de rayons X en vérifiant que la pointe de seringue rencontre le réticule qui sont visibles dans l’image du microscope optique générée par la caméra beamline.</li>
		<li>Une fois que la pointe de l’aiguille est alignée déplacer la pointe au-dessus des poils croisés ~ 100 μm. Cela élimine la dispersion des rayons X de la pointe de l’aiguille. REMARQUE : Le montage et l’alignement de l’injecteur sur la ligne de faisceau MX2 au synchrotron doivent être effectués par les scientifiques de la ligne de faisceau et peuvent être complétés en moins de 30 minutes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montage de la seringue d’échantillon
<ol><li>Remplacer la seringue vide par la seringue de l’échantillon en suivant l’étape 2.3.</li>
	<li>Placez le bouchon d’injecteur sur la tête du piston de seringue de l’échantillon.</li>
	<li>Déplacez la vis d’entraînement vers le haut du bouchon.</li>
	<li>Dans le logiciel de contrôle injecteur sélectionnez le mode Velocity.</li>
	<li>Entrée 3000 rpm (~115 nL/s) comme valeur de réglage et appuyez sur Appliquer la valeur de réglage.</li>
	<li>Lorsque la vis d’entraînement touche le bouchon sur la tête du piston de seringue, arrêtez le moteur.<ol>
<li>Réglez la valeur du régime à zéro dans le logiciel de contrôle de l’injecteur en changeant la valeur de réglage à « 0 » à mesure que la vis s’approche du bouchon.</li>
		<li>Une fois le contact effectué, activez la valeur prédéfinise en appuyant sur Appliquer la valeur de réglage pour arrêter la vis instantanément.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agiter doucement le bouchon pour s’assurer qu’il est fermement maintenu en place. REMARQUE : Chaque fois qu’une nouvelle valeur définie est entrée dans la boîte de valeur de réglage dans le logiciel de contrôle, elle n’est activée qu’après avoir appuyé sur la valeur de réglage d’application.</li>
</ol>4. Exécution de l’injecteur
<ol><li>Une fois que la vis d’entraînement du bouchon a pris contact ferme avec le haut du piston, changez la valeur de réglage du régime à 100. Cela équivaut à ~ 4 nL/s.</li>
	<li>Inspectez visuellement la pointe de l’aiguille lorsque l’échantillon sort ou regardez l’image de la caméra beamline de l’aiguille pour observer quand l’échantillon commence à extruder de la pointe de l’aiguille.</li>
	<li>Effectuez une fouille du clapier, fermez la porte de la huche et allumez le faisceau de rayons X. À partir de ce point, l’injecteur doit être actionné à distance de l’extérieur du clapier.</li>
	<li>Réglez le régime jusqu’à ce qu’un flux stable soit généré.<ol>
<li>Réduire la valeur de réglage du régime à 90.</li>
		<li>Répétez l’étape 4.4.1, en diminuant la valeur de réglage du régime par incréments de 10, pour ralentir le flux tout en maintenant un flux stable. Pour la graisse de silicone une valeur de 30 rpm a été utilisée. REMARQUE : La plage typique du régime varie entre 30 et 100 rpm (1 à 4 nL/s) selon les caractéristiques de l’échantillon et le temps d’exposition aux rayons X. En général, le régime doit être réglé pour produire le débit le plus lent (afin de minimiser la consommation d’échantillons) tout en maintenant un flux stable.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gestion d’un flux d’échantillons qui ne coule pas bien.<ol>
<li>Continuez d’augmenter la valeur de réglage du régime par incréments de 10 jusqu’à ce que le flux soit plus droit. Si le flux ne se stabilise pas, même après avoir augmenté la valeur de réglage du régime à la valeur maximale de 100 rpm, essayez d’améliorer la stabilité en implémentant l’une des deux méthodes décrites ci-dessous.<ol>
<li>Première méthode : Insérez un échantillonneur de polystyrène sous le flux d’échantillons pour aider à guider l’échantillon. Cette méthode fonctionne bien pour les flux d’échantillons hautement chargés.</li>
			<li>Deuxième méthode : Insérez un entonnoir d’aspiration venturi à l’échantillonneur. Pour fournir de l’air à l’entonnoir, connectez-le au tube de sortie d’air situé dans le clapier. Cette méthode peut aider à diriger et stabiliser le flux d’échantillons indépendamment de la charge du flux.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une fois qu’un flux constant et régulier est atteint, commencez la collecte de données et optimisez la distance du détecteur selon une expérience normale de cristallographie aux rayons X. REMARQUE : Le régime est converti en débit à l’aide de la table de conversion fournie dans l’information supplémentaire, « Calculateur d’appareils Lipidico ». Entrez la valeur du régime, le diamètre des aiguilles et les volumes de seringues pour calculer le débit à l’aide de cette calculatrice.</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+millisecond+crystallography+of+membrane+and+soluble+protein+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).</li><li>Berntsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+millisecond+crystallography+instrument+at+the+Australian+Synchrotron+incorporating+the+"Lipidico"+injector.">The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector.</a> Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).</li><li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams.">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).</li><li>DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N., Tschentscher, T., Cocco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+injection+for+pulsed+X-ray+sources.">Sample injection for pulsed X-ray sources.</a> Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. , 8078 (2011).</li><li>Park, S. Y., Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+delivery+using+viscous+media,+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography.">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li><li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure.">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li><li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography.">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li><li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography.">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345 (2016).</li><li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography.">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography.">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484 (2016).</li><li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase.">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li><li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography.">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).</li><li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography.">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li><li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography.">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li><li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science:+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art.">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li></ol>

MK travaille pour les designs Kusel. Kusel Design, un développeur d’appareils de laboratoire personnalisé, a été engagé par le Dr Peter Bentsen de l’Université De La Trobe et le Dr Tom Caradoc-Davies de l’ANSTO et de développer un dispositif à faible coût pour permettre des études visqueuses élevées dans la ligne de faisceau MX2 au Synchrotron australien. Le dispositif a été développé en étroite consultation avec le Dr Caradoc-Davies. Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Une alternative HVI a été développée, idéale pour effectuer des expériences SX à des sources synchrotron. Il présente deux avantages clés par rapport aux IDH existants. Tout d’abord, il est facile à installer sur la ligne de faisceau permettant une commutation rapide entre la cristallographie conventionnelle et SX, seulement ~ 30 minutes est nécessaire pour l’installation et l’alignement sur MX2. Deuxièmement, les seringues d’échantillon utilisées pour faire pousser des cristaux peuvent être direct...

La cristallographie en série (SX) est une technique qui a été développée initialement dans le contexte des lasers à électrons libres à rayons X (XFELs)1,2,3,4. Bien que les approches à cibles fixes puissent être utilisées pour SX5,6,7, généralement, les systèmes d’injection sont utilisés pour livrer des cristaux dans un flux continu au faisceau de rayons X. Parce qu’il combine les données d’un grand nombre de cristaux, SX évite la nécessité d’un alignement de cristal pendant l’expérience, et permet de recueillir des données à températureambiante 8,9. À l’aide d’un injecteur approprié, les cristaux sont diffusés un par un dans la zone d’interaction aux rayons X et les données de diffraction qui en résultent sont recueillies sur un détecteur dezone 9,10. À ce jour, SX a réussi à résoudre un certain nombre de structures protéiques1,11,12,13, y compris les cristaux trop petits pour être mesurer à l’aide de la cristallographie conventionnelle. Il a également fourni de nouvelles perspectives sur la dynamique moléculaire résolue dans le temps en exploitant la durée de l’impulsion femtoseconde du XFEL. En lançant des réactions pompe-sonde avec des sources laser optiques, des études approfondies ont été menées sur le photosystème II14,15, protéine jaune photoactive16,17, cytochrome C oxidase18, ainsi que la bactériorhodopsine19,20,21. Ces études ont sondé la dynamique de transfert d’électrons qui se produit après l’activation de la lumière démontrant le potentiel significatif de la cristallographie en série pour comprendre les processus biologiques résolus dans le temps.
Le développement de la cristallographie en série est également de plus en plus répandu aux sources synchrotron9,12,20,22,23,24. Le SX à base de synchrotron permet de mesurer efficacement un grand nombre de cristaux individuels à température ambiante à l’aide d’un système d’injection approprié. Cette approche convient aux cristaux plus petits, donc, en plus d’exiger un détecteur rapide de taux d’image pour recueillir les données, un faisceau micro-focalisé est également nécessaire. Par rapport à la cristallographie conventionnelle, SX n’implique pas le montage et l’alignement des cristaux individuels dans le faisceau de rayons X. Étant donné que les données d’un grand nombre de cristaux individuels sont fusionnées, la dose de rayonnement reçue par chaque cristal peut être considérablement réduite par rapport à la cristallographie conventionnelle. Synchrotron SX peut également être appliqué à l’étude des réactions résolues dans le temps, même jusqu’au régime milliseconde, à condition qu’un détecteur avec un taux d’image suffisamment élevé est disponible (par exemple, 100 Hz ou plus). Plusieurs expériences de cristallographie en série ont été réalisées au synchrotron à l’aide d’injecteurs initialement développés aux sources XFEL20,22,23. Les deux types les plus communs d’injecteur sont la buse virtuelle dynamique de gaz (GDVN)25 et l’injecteur visqueux élevé (HVI)9,24,26,27,28. Le GDVN est idéal pour injecter de faibles viscosités, des échantillons liquides, mais nécessite des débits élevés pour atteindre des débits stables, ce qui conduit à des taux élevés de consommation d’échantillons. En revanche, les HVI conviennent aux échantillons de viscosité élevée qui permettent la production d’un flux stable à des débits beaucoup plus faibles, ce qui entraîne une consommation d’échantillons beaucoup plus faible. L’injecteur HVI favorise donc la livraison d’échantillons lorsqu’un porteur visqueux est préférable (p. ex., à base de lipides pour les protéines membranaires) et/ou que de grandes quantités d’échantillons ne sont pas disponibles. Les injecteurs SX sont généralement difficiles à utiliser et nécessitent une formation approfondie pour fonctionner. Il s’agit également de protocoles de transfert d’échantillons longs, car l’échantillon doit être chargé dans un réservoir spécialisé, ce qui comporte généralement un risque élevé associé à la perte d’échantillons dans le « volume mort » ou par des fuites dans les connexions. Par conséquent, il est souhaitable d’optimiser la conception de l’injecteur pour atténuer les pertes avant que l’échantillon n’atteigne le faisceau de rayons X.
Récemment, les premiers résultats SX ont été publiés à l’aide de Lipidico23 avec une cible lysozyme, à l’aide d’un détecteur Eiger 16M. Cette conception d’injecteur limite le gaspillage de l’échantillon en minimisant le nombre d’étapes impliquées dans le fait de passer de la cristallisation initiale au transfert de cristaux dans l’injecteur, suivi de la livraison de l’échantillon au faisceau de rayons X. Ce manuscrit décrit et démontre la procédure de transfert de l’échantillon à partir de la préparation de l’échantillon, du passage au processus d’injection, et enfin de la collecte de données, à l’aide du même récipient de cristallisation. Le fonctionnement de l’injecteur est également décrit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hen eggwhite lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicon grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector needle (108 &#181;m ID)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part No: 7803-05</td>
			<td>www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas-tight syringes, 100 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part no: 7656-01</td>
			<td>Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCP syringe coupler</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>209526</td>
			<td>Syringe coupler to mix the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidico injector</td>
			<td>La Trobe Univerity/ANSTO</td>
			<td></td>
			<td>This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron

Une installation pour effectuer des mesures de cristallographie en série a été développée au synchrotron australien. Cette installation intègre un injecteur visqueux élevé construit à cet effet, Lipidico, dans le cadre de la cristallographie macromoléculaire (MX2) beamline pour mesurer un grand nombre de petits cristaux à température ambiante. L’objectif de cette technique est de permettre aux cristaux d’être cultivés/transférés dans des seringues en verre pour être utilisés directement dans l’injecteur pour la collecte de données de cristallographie en série. Les avantages de cet injecteur comprennent la capacité de réagir rapidement aux changements dans le débit sans interruption du flux. Plusieurs limitations pour cet injecteur de viscosité élevée (HVI) existent qui incluent une restriction sur les viscosités autorisées d’échantillon à >10 Pa.s. La stabilité du flux peut également être un problème en fonction des propriétés spécifiques de l’échantillon. Un protocole détaillé sur la façon de mettre en place des échantillons et d’utiliser l’injecteur pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien est présenté ici. La méthode démontre la préparation de l’échantillon, y compris le transfert de cristaux de lysozyme dans un média visqueux élevé (graisse de silicone), et le fonctionnement de l’injecteur pour la collecte de données à MX2.

Lipidico est un HVI construit comme un système de livraison alternatif pour une utilisation sur MX2 (Figure 1). Il est idéal pour SX où les cristaux sont soit cultivés en phase cubique lipidique ou transférés à un média inerte visqueux élevé.
Pour démontrer l’application injecteur, de la graisse de silicone mélangée à des cristaux de lysozyme a été utilisée pour recueillir des données SX à la ligne de faisceau MX2 au synchrotron australien. Po...

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Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

L’objectif de ce protocole est de démontrer comment préparer des échantillons de cristallographie en série pour la collecte de données sur un injecteur visqueux élevé, Lipidico, récemment commandé au synchrotron australien.

Protocole d’injection lipidique pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.2K vues.  La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086. L’objectif de ce protocole est de démontrer comment préparer des échantillons de cristallographie en série pour la collecte de données sur un injecteur visqueux élevé, Lipidico, récemment commandé au synchrotron australien.

Vidéo: Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Recherche

Bio-ingénierie

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Utilisation Tomoauto: Un protocole pour la tomographie à haut débit automatisé cryo-électronique

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthèse des hydrogels avec des propriétés antisalissure Membranes pour la purification de l&#39;eau

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Mesures d’entrée de puissance dans des bioréacteurs brassées à l’échelle du laboratoire

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Injection de nanoparticules de Retroductal à la glande submandibulaire Murine

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

Système centrifuge automatisé de contre-flux pour le traitement cellulaire à petite échelle

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized matrix. This organization is challenging to replicate due to the heterogeneous environment of bone. Ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions (COBICS) is a microgel-based bioprinting technique that uniquely replicates the mineral and cellular structure of bone. COBICS prints complex, biologically relevant constructs without the need for sacrificial support materials or harsh postprocessing steps (e.g., radiation and high-temperature sintering), which are two of the biggest challenges in the additive manufacturing of bone mimetic constructs. This technique is enabled via the freeform extrusion of a novel calcium phosphate-based ink within a gelatin-based microgel suspension. The yield-stress properties of the suspension allow deposition and support the printed bone structure. UV crosslinking and nanoprecipitation then "lock" it in place. The ability to print nanostructured bone-mimetic ceramics within cell-laden biomaterials provides spatiotemporal control over macro- and micro-architecture and facilitates the real-time fabrication of complex bone constructs in clinical settings.

This protocol describes a 3D printing technique to fabricate bone-like structures by depositing a calcium phosphate ink in a gelatin-based granular support. Printed bone analogs are deposited in freeform, with flexibility for direct harvesting of the print or crosslinking within a living cell matrix for multiphasic constructs.

Bio-impression omnidirectionnelle céramique dans des suspensions chargées de cellules pour la génération d’analogues osseux

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a chemotherapeutic might be functionalized with an antibody to enhance binding to cancer cells (&#34;targeting&#34;) or functionalized with polyethylene glycol to help evade immune cell recognition (&#34;stealth&#34;). Even at a cellular level, optimizing the binding and uptake of a drug carrier is a complex biological design problem. Thus, it is valuable to separate how strongly a new carrier interacts with a cell from the functional efficacy of a carrier&#39;s cargo once delivered to that cell.
To continue the chemotherapeutic example, &#34;how well it binds to a cancer cell&#34; is a separate problem from &#34;how well it kills a cancer cell&#34;. Quantitative in vitro assays for the latter are well established and usually rely on measuring viability. However, most published research on cell-carrier interactions is qualitative or semiquantitative. Generally, these measurements rely on fluorescent labeling of the carrier and, consequently, report interactions with cells in relative or arbitrary units. However, this work can be standardized and be made absolutely quantitative with a small number of characterization experiments. Such absolute quantification is valuable, as it facilitates rational, inter- and intra-class comparisons of various drug delivery systems-nanoparticles, microparticles, viruses, antibody-drug conjugates, engineered therapeutic cells, or extracellular vesicles.
Furthermore, quantification is a prerequisite for subsequent meta-analyses or in silico modeling approaches. In this article, video guides, as well as a decision tree for how to achieve in vitro quantification for carrier drug delivery systems, are presented, which take into account differences in carrier size and labeling modality. Additionally, further considerations for the quantitative assessment of advanced drug delivery systems are discussed. This is intended to serve as a valuable resource to improve rational evaluation and design for the next generation of medicine.

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A workflow is demonstrated for the absolute quantification of drug carrier-cell interactions using flow cytometry to allow better rational evaluation of novel drug delivery systems. This workflow is applicable to drug carriers of any type.

Quantification expérimentale des interactions entre les systèmes d’administration de médicaments et les cellules in vitro : Guide d’évaluation préclinique de la nanomédecine

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Une nouvelle méthode d’injection lente mini-invasive pour réduire les lésions tissulaires

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

Pleins feux sur l’auteur : Une nouvelle méthode d’injection cellulaire avec une invasion minimale  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Une nouvelle méthode d’injection cellulaire avec un minimum d’invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...