Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Questa ricerca è stata intrapresa in parte utilizzando la linea di fascio MX2 presso l'Australian Synchrotron, parte dell'ANSTO, e ha fatto uso del rivelatore Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

1. Preparazione di cristalli in un mezzo ad alta viscosità utilizzando siringhe di vetro
<ol><li>Centrifugare delicatamente la soluzione cristallina (~1.000 x g,~10 min a 22 °C) per formare un pellet di cristallo morbido e rimuovere il tampone in eccesso. Ciò si tradurrà in un'alta concentrazione di cristalli nel pellet che possono essere utilizzati per la raccolta dei dati. NOTA: Per evitare la diluizione del supporto viscoso aumentare la concentrazione cristallina in questa fase. Ottimizzare il rapporto tra media viscoso e volume cristallino per ogni campione per ottenere un'alta concentrazione di cristalli mantenendo un'elevata viscosità per il supporto. Centrifugare la soluzione cristallina per formare un pellet e rimuovere il tampone in eccesso per aumentare la concentrazione di cristalli nella soluzione, come descritto in Darmanin et. al.29.</li>
	<li>Impostare due siringhe da 100 μL con un accoppiatore.</li>
	<li>Fissare l'accoppiatore alla fine della prima siringa e aggiungere 28 μL di soluzione cristallina alla parte superiore della siringa. Lentamente, inserire lo stantuffo nella parte superiore della siringa e spingere delicatamente la soluzione fino all'estremità della punta dell'accoppiatore, rimuovendo eventuali bolle d'aria che si formano. Fallo seguendo uno dei due metodi discussi di seguito. NOTA: Il volume dei cristalli da aggiungere al supporto ad alta viscosità può essere variato se non cambia significativamente la viscosità del campione complessivo.<ol>
<li>Primo metodo: utilizzare rapidi cambi di pressione per far scoppiare le bolle d'aria.<ol>
<li>Posizionare con cura un dito guantato sulla parte superiore del punto dell'ago dell'accoppiatore smussato e (molto delicatamente) applicare la pressione per creare una guarnizione. Non applicare troppa pressione in quanto ciò potrebbe causare una lesione del bastone dell'ago.</li>
			<li>Ora tira indietro lo stantuffo per allontanare la soluzione dal punto dell'ago, questo genererà un accumulo di pressione nella siringa.</li>
			<li>Rilasciare rapidamente la pressione nella parte superiore della siringa rimuovendo il dito guantato dalla punta smussata dell'ago. Fai attenzione, se il campione è troppo vicino alla punta quando il dito viene rimosso, potrebbe spruzzare con conseguente perdita di campione. Il rapido cambiamento di pressione all'interno della siringa farà scoppiare le bolle d'aria. Ripetere fino a quando tutte le bolle sono state rimosse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Secondo metodo: utilizzare la "centrifuga umana" per rimuovere le bolle d'aria.<ol>
<li>Posizionare la siringa in una mano con l'ago rivolto verso l'alto e lo stantuffo incastrato tra due dita, in modo che non possa muoversi.</li>
			<li>Ruotare rapidamente il braccio tenendo la siringa in una direzione 2-3 volte, la forza centrifuga risultante sul campione costringerà eventuali bolle d'aria fuori dalla siringa. Fai attenzione, se fatto troppo lentamente il campione può andare perso.</li>
			<li>Ispezionare la siringa alla ricerca di bolle d'aria, se rimangono bolle, ripetere i passaggi da 1.3.2.1 a 1.3.2.2 fino a rimuovere tutte le bolle d'aria.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzando una spatola fine, aggiungere ~42 μL di grasso siliconico ad alto vuoto direttamente nella parte superiore della seconda siringa. Spingere lo stantuffo fino alla fine, rimuovendo tutte le bolle d'aria e assicurandosi che non vi sia spazio d'aria alla fine della siringa. NOTA: La composizione precisa del grasso siliconico non è critica in quanto agisce come un supporto inerte. Un valore di viscosità di >10 Pa.s o un rapporto di circa 60:40 grasso siliconico in soluzione cristallina è ottimale per l'iniezione, tuttavia, è possibile che questo possa variare a seconda delle caratteristiche esatte del campione. Regolare il volume della soluzione cristallina aggiunta al grasso siliconico per ottimizzare la concentrazione cristallina nella miscela, come delineato nella discussione. I mezzi ad alta viscosità diversi dal grasso siliconico possono essere utilizzati purché siano compatibili con ilcampione 30,31,32,33.</li>
	<li>Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria in una delle due siringhe e attaccare le siringhe insieme utilizzando l'accoppiatore. Tenere le siringhe verticalmente afferrando solo l'estremità della siringa poiché riscaldare la siringa a causa del calore generato dalle dita può influenzare il campione.</li>
	<li>Mescolare il campione deprimendo delicatamente lo stantuffo sul lato della soluzione cristallina in modo che si mescoli nel grasso siliconico e quindi spingere lo stantuffo sul lato del grasso siliconico, in modo che spingi il campione verso il lato della soluzione cristallina. Ripetere delicatamente questo processo da 50 a 100 volte in modo che il campione sia miscelato accuratamente e sembri omogeneo. NOTA: Se i cristalli vengono coltivati direttamente in mezzi altamente viscosi (ad esempio, fase cubica lipidica, LCP), non sono necessari passaggi 1.1-1.6. Protocolli per la coltivazione di cristalli all'interno delle siringhe possono essere trovati in Liu et.al. 34di35. Seguire questo protocollo fino al consolidamento del campione, passaggio 10, in cui tutto il campione è ora contenuto in una siringa e il buffer di cristallizzazione viene rimosso. L'aggiunta di 7.9MAG non è necessaria per questo protocollo. Invece, rimuovere tutto il liquido in eccesso dalla siringa spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso nel campione fino a quando non rimane più liquido nella siringa.</li>
	<li>Visualizzare i cristalli al microscopio ottico attraverso la siringa o, per ottenere i migliori risultati, estrarre una piccola quantità (~1 μL) su uno scivolo di vetro e posizionare uno scivolo di copertura sulla parte superiore.</li>
	<li>Controllare la concentrazione del cristallo.<ol>
<li>Determinare la concentrazione cristallina nel grasso siliconico contando il numero di cristalli in un'area specifica utilizzando le immagini del microscopio ottico. Per ottenere i migliori risultati, un'alta densità di cristalli erogati uniformemente su tutto il supporto è ideale (>106 cristalli/mL) per ottenere un'elevata velocità di colpo di cristallo.</li>
		<li>Regolare la concentrazione cristallina nella siringa modificando il rapporto tra cristalli e mezzi viscosi nei passaggi 1.3 e 1.4.<ol>
<li>Per diminuire la concentrazione cristallina, diluire i cristalli nella siringa aumentando la quantità di grasso siliconico/mezzi HV al passaggio 1.4 o diluire il pellet di cristallo in soluzione con il tampone di cristallizzazione prima di impostare le siringhe nel passaggio 1.1.</li>
			<li>Per aumentare la concentrazione cristallina, diminuire la quantità di grasso siliconico nel passaggio 1.4 ma fare attenzione a non ridurre la viscosità al di sotto di 10 Pa.s. NOTA: La concentrazione di cristalli qui riportata è stata ottimizzata per questo campione specifico e le dimensioni del cristallo. Tuttavia, la concentrazione cristallina ideale dipenderà dalle dimensioni del cristallo, dalle dimensioni del fascio, dal diametro interno dell'ago (I.D.) e dal flusso di raggi X incidente. Questo può essere determinato dal tasso di hit con un tasso di successo ottimale di ~ 30% considerato "buono". In pratica, la concentrazione di cristallo deve essere ottimizzata per diversi campioni durante il tempo del fascio per ottenere la velocità di colpo desiderata. Inizia con un'alta concentrazione di cristalli, 109 cristalli / mL. La procedura per regolare la concentrazione cristallina è data in Liu et.al. 35 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Il protocollo può essere messo in pausa qui fino a quando l'iniettore non è pronto per la raccolta dei dati.<ol>
<li>Se i cristalli vengono coltivati in LCP, sigillarli e lasciarli rimanere nelle siringhe per un massimo di alcuni giorni a temperatura ambiente.</li>
			<li>Se i cristalli sono stati trasferiti su un diverso supporto ad alta viscosità (ad esempio, grasso siliconico), prima della misurazione deve essere eseguita una prova di stabilità dei cristalli nel tempo. Questo determinerà per quanto tempo i cristalli sono stabili nei supporti inerti (idealmente > 8 h) e il limite di tempo per la raccolta dei dati. Qui, i cristalli di lisozima erano stabili per giorni nel grasso siliconico e non mostravano segni di dissoluzione quando ispezionati utilizzando un microscopio ottico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Spostare tutto il campione in un'unica siringa prima di scollegare l'accoppiatore. Scollegare l'accoppiatore dalla siringa e attaccare l'ago di iniezione. Avvitare saldamente l'ago nella base della siringa e assicurarsi che sia fissato saldamente per evitare perdite. Per questo esperimento è stato utilizzato un ago I.D. da 108 μm (lunghezza dell'ago 13 mm, stile punto 3). A seconda delle dimensioni del cristallo e della dimensione del fascio, fissare un ago I.D. da 51 μm o 108 μm. NOTA: È necessario pre-test del flusso del campione prima del tempo del fascio per poter selezionare la dimensione corretta dell'ago dell'iniettore. A seconda delle caratteristiche del campione (cioè viscosità, carica, composizione tampone) e dell'I.D. dell'ago, i campioni fluiranno in modo diverso. Pertanto, si consiglia di testare una varietà di dimensioni degli aghi per produrre il flusso più stabile con il più piccolo ago di I.D. possibile per massimizzare il rapporto segnale-rumore durante la raccolta dei dati.</li>
	<li>Se l'iniettore è già montato e allineato sulla linea del fascio, spostarsi nella sezione 3 e montare la siringa campione direttamente sull'iniettore. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>2. Montaggio e controllo dell'iniettore
<ol><li>Montare l'iniettore sulla linea di fascio. Rimuovere l'ugello criogenico sulla linea di fascio MX2 e sostituirlo con l'iniettore. Allentare la vite di bloccaggio che tiene l'ugello criogenico e fissarlo alla staffa situata accanto allo stadio motorizzato.</li>
	<li>Sollevare l'iniettore dal carrello tenendo la maniglia nera e posizionarla sul palco motorizzato.<ol>
<li>Per fissare l'iniettore allo stadio motorizzato; stringere a mano la manopola della vite di bloccaggio nero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montare una siringa vuota sull'iniettore<ol>
<li>Nell'interfaccia di controllo del computer dell'iniettore (ad esempio, il software di controllo della posizione EPOS), selezionare Modalità homing in Strumenti nel menu software. Quindi selezionare Negative Limit Switch e Start Homing, lasciare funzionare il software fino a quando la vite non viene ritrasferita a sufficienza affinché la siringa si adatti sotto la vite. Se lasciato per funzionare senza supervisione, l'interruttore limite arresta automaticamente la vite.</li>
		<li>Montare una siringa vuota ('fittizia') sull'iniettore inserendo l'ago attraverso la fessura nel supporto della siringa. Allineare la siringa contro la staffa.</li>
		<li>Fissare la siringa con due O-ring.<ol>
<li>Avvolgere il primo O-ring attraverso la sezione centrale della siringa attaccandolo ai ganci su entrambi i lati della siringa.</li>
			<li>Eseguire il ciclo del secondo O-ring attorno ai ganci sulla sezione superiore della siringa, quindi mettere una parte dell'O-ring sulla parte superiore della siringa di vetro, come mostrato nella dimostrazione e nella figura 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allineare l'iniettore al fascio di raggi X<ol>
<li>Spostare lo stadio motorizzato con l'iniettore verso il punto di interazione a raggi X tramite il software di controllo della linea di fascio. Questo può essere visualizzato utilizzando la fotocamera in linea. Le dimensioni e la posizione del fascio sono denotati da una croce rossa sullo schermo e lo stadio motorizzato può essere spostato per allineare l'ago con la regione di interazione a raggi X.</li>
		<li>Regolare la posizione x e y del palco per allineare l'ago con la croce rossa.</li>
		<li>Regolare la posizione z fino a quando la punta dell'ago non entra a fuoco.</li>
		<li>Verificare visivamente l'allineamento della punta dell'ago e del fascio di raggi X verificando che la punta della siringa soddisfi i mirini visibili nell'immagine del microscopio ottico generata dalla telecamera beamline.</li>
		<li>Una volta allineata la punta dell'ago, spostare la punta sopra i peli incrociati ~ 100 μm. Ciò elimina la dispersione dei raggi X dalla punta dell'ago. NOTA: Il montaggio e l'allineamento dell'iniettore sulla linea di fascio MX2 sul sincrotrone deve essere effettuato dagli scienziati della linea di fascio e può essere completato in meno di 30 minuti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montaggio della siringa campione
<ol><li>Sostituire la siringa vuota con la siringa campione seguendo il passaggio 2.3.</li>
	<li>Posizionare il cappuccio dell'iniettore sulla testa dello stantuffo della siringa campione.</li>
	<li>Spostare la vite di azionamento nella parte superiore del cappuccio.</li>
	<li>Nel software di controllo dell'iniettore selezionare Modalità velocità.</li>
	<li>Immettere 3000 giri/min (~115 nL/s) come valore di impostazione e premere Applica valore di impostazione.</li>
	<li>Quando la vite di azionamento tocca il cappuccio sulla testa dello stantuffo della siringa, arrestare il motore.<ol>
<li>Impostare il valore rpm su zero nel software di controllo dell'iniettore modificando il valore di impostazione su '0' man mano che la vite si avvicina al cappuccio.</li>
		<li>Una volta effettuato il contatto, attivare il valore preimpostato premendo Applica valore di impostazione per arrestare immediatamente la vite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Muovere delicatamente il cappuccio per assicurarsi che sia saldamente tenuto in posizione. NOTA: ogni volta che un nuovo valore impostato viene immesso nella casella Valore impostazione nel software di controllo, viene attivato solo dopo aver premuto Applica valore di impostazione.</li>
</ol>4. Esecuzione dell'iniettore
<ol><li>Dopo che la vite di azionamento del tappo ha avuto un contatto fermo con la parte superiore dello stantuffo, modificare il valore di impostazione del numero di giri su 100. Questo è equivalente a ~ 4 nL/s.</li>
	<li>Ispezionare visivamente la punta dell'ago quando il campione esce per la prima volta o guardare l'immagine della telecamera beamline dell'ago da osservare quando il campione inizia a estrudere dalla punta dell'ago.</li>
	<li>Eseguire una ricerca dell'hutch, chiudere la porta dell'hutch e accendere il fascio di raggi X. Da questo punto l'iniettore deve essere azionato a distanza dall'esterno dell'hutch.</li>
	<li>Sintonizzare il numero di giri/min fino a generare un flusso stabile.<ol>
<li>Ridurre il valore di impostazione del numero di giri/min su 90.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.4.1, riducendo il valore di impostazione del numero di giri in incrementi pari a 10, per rallentare il flusso ma mantenere comunque un flusso stabile. Per il grasso di silicone è stato utilizzato un valore di 30 giri/min. NOTA: La tipica gamma di giri/min varia tra 30 e 100 giri/min (1 - 4 nL/s) a seconda delle caratteristiche del campione e del tempo di esposizione ai raggi X. In generale, i giri/min devono essere sintonizzati per produrre la portata più lenta (per ridurre al minimo il consumo del campione) mantenendo un flusso stabile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gestione di un flusso di esempio che non scorre bene.<ol>
<li>Continua ad aumentare il valore di impostazione rpm con incrementi di 10 fino a quando il flusso non diventa più dritto. Se il flusso non si stabilizza, anche dopo aver aumentato il valore di impostazione rpm al valore massimo di 100 rpm, provare a migliorare la stabilità implementando uno dei due metodi descritti di seguito.<ol>
<li>Primo metodo: inserire un ricevitore di campioni di polistirolo sotto il flusso di esempio per guidare l'esempio. Questo metodo funziona bene per flussi di campioni altamente carichi.</li>
			<li>Secondo metodo: inserire un imbuto di aspirazione venturi nel catcher del campione. Per fornire aria all'imbuto, collegarla al tubo di uscita dell'aria situato nell'hutch. Questo metodo può aiutare a dirigere e stabilizzare il flusso del campione indipendentemente dalla carica del flusso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta raggiunto un flusso costante e costante, avviare la raccolta dei dati e ottimizzare la distanza del rivelatore secondo un normale esperimento di cristallografia a raggi X. NOTA: Il numero di giri/min viene convertito in portata utilizzando la tabella di conversione fornita nelle informazioni supplementari ,'Lipidico Device Calculator'. Immettere il valore rpm, i diametri dell'ago e i volumi delle siringhe per calcolare la portata utilizzando questo calcolatore.</li>
</ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+delivery+using+viscous+media,+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography.">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li><li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure.">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li><li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography.">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li><li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography.">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345 (2016).</li><li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography.">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography.">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484 (2016).</li><li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase.">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li><li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography.">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).</li><li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography.">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li><li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography.">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li><li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science:+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art.">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li></ol>

MK lavora per progetti Kusel. Kusel Design, uno sviluppatore di dispositivi di laboratorio personalizzato, è stato ingaggiato dal Dr Peter Bentsen della La Trobe University e dal Dr Tom Caradoc-Davies dell'ANSTO e per sviluppare un dispositivo a basso costo per consentire studi ad alta viscosità nella linea di travi MX2 presso l'Australian Synchrotron. Il dispositivo è stato sviluppato in stretta consultazione con il Dr. Caradoc-Davies. Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

È stato sviluppato un HVI alternativo, ideale per effettuare esperimenti SX a sorgenti di sincrotrone. Ha due vantaggi chiave rispetto agli HVI esistenti. Innanzitutto, è facile da installare sulla linea di fascio consentendo un rapido passaggio tra la cristallografia convenzionale e SX, sono necessari solo ~ 30 minuti per l'installazione e l'allineamento su MX2. In secondo luogo, le siringhe campione utilizzate per coltivare cristalli possono essere utilizzate direttamente come serbatoi per iniezione, limitando gli sp...

La cristallografia seriale (SX) è una tecnica sviluppata inizialmente nel contesto dei laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL)1,2,3,4. Sebbene gli approcci target fissi possano essere utilizzati per SX5,6,7, in genere, i sistemi di iniettori vengono utilizzati per fornire cristalli in un flusso continuo al fascio di raggi X. Poiché combina i dati di un gran numero di cristalli, SX evita la necessità di qualsiasi allineamento cristallino durante l'esperimento e consente di raccogliere dati a temperaturaambiente 8,9. Con l'aiuto di un iniettore adatto, i cristalli vengono trasmessi uno per uno nell'area di interazione a raggi X e i dati di diffrazione risultanti vengono raccolti su un rilevatore di area9,10. Ad oggi, SX è riuscita a risolvere un certo numero di strutture proteiche1,11,12,13 compresii cristalli troppo piccoli per misurare usando la cristallografia convenzionale. Ha anche fornito nuove informazioni sulla dinamica molecolare risolta nel tempo sfruttando la durata dell'impulso del femtosecondo dell'XFEL. Avviando reazioni pompa-sonda con sorgenti laser ottiche, sono stati effettuati studi approfonditi sul fotosistema II14,15, proteina gialla fotoattiva16,17, citocromo C ossidasi18, nonché batteriorhodopsina19,20,21. Questi studi hanno sondato la dinamica di trasferimento degli elettroni che si verifica dopo l'attivazione della luce dimostrando il significativo potenziale della cristallografia seriale per comprendere i processi biologici risolti nel tempo.
Lo sviluppo della cristallografia seriale sta diventando sempre più diffuso anche nelle sorgenti di sincrotrone9,12,20,22,23,24. L'SX a base di sincrotrone consente di misurare in modo efficiente un gran numero di singoli cristalli a temperatura ambiente utilizzando un sistema di iniettore appropriato. Questo approccio è adatto per cristalli più piccoli, quindi, oltre a richiedere un rilevatore di frame-rate veloce per raccogliere i dati, è richiesto anche un fascio micro-focalizzato. Rispetto alla cristallografia convenzionale, SX non comporta il montaggio e l'allineamento di singoli cristalli nel fascio di raggi X. Poiché i dati provenienti da un gran numero di singoli cristalli vengono fusi, la dose di radiazioni ricevuta da ciascun cristallo può essere sostanzialmente ridotta rispetto alla cristallografia convenzionale. Synchrotron SX può anche essere applicato allo studio di reazioni risolte nel tempo, anche fino al regime millisecondo, a condizione che sia disponibile un rilevatore con una frequenza fotogrammi sufficientemente elevata (ad esempio, 100 Hz o più). Diversi esperimenti di cristallografia seriale sono stati effettuati presso il sincrotrone utilizzando iniettori che sono stati inizialmente sviluppati a sorgenti XFEL20,22,23. I due tipi più comuni di iniettore sono l'ugello virtuale dinamico a gas (GDVN)25 e l'iniettore ad alta viscosità (HVI)9,24,26,27,28. Il GDVN è ideale per iniettare bassa viscosità, campioni liquidi, ma richiede elevate portate per ottenere flussi stabili, il che a sua volta porta ad alti tassi di consumo del campione. Al contrario, gli HVI sono adatti per campioni ad alta viscosità che consentono la generazione di un flusso stabile a portate molto più basse, portando a un consumo di campioni molto più basso. L'iniettore HVI, quindi, favorisce la consegna di campioni in cui è preferibile un vettore viscoso (ad esempio, a base lipidica per proteine di membrana) e / o grandi quantità di campione non sono disponibili. Gli iniettori SX sono generalmente difficili da usare e richiedono un'ampia formazione per funzionare. Essi comportano anche lunghi protocolli di trasferimento del campione, in quanto il campione deve essere caricato in un serbatoio specializzato, il che presenta generalmente un alto rischio associato alla perdita del campione nel "volume morto" o tramite perdite nelle connessioni. Pertanto, è auspicabile ottimizzare il design dell'iniettore per mitigare eventuali perdite prima che il campione raggiunga il fascio di raggi X.
Recentemente, i primi risultati SX sono stati pubblicati utilizzando Lipidico23 con un bersaglio di lisozima, utilizzando un rilevatore Eiger 16M. Questa progettazione dell'iniettore limita lo spreco di campioni riducendo al minimo il numero di passaggi necessari per andare dalla cristallizzazione iniziale al trasferimento dei cristalli nell'iniettore seguito dalla consegna del campione al fascio di raggi X. Questo manoscritto descrive e illustra la procedura di trasferimento del campione a partire dalla preparazione del campione, passando al processo di iniezione e infine alla raccolta dei dati, utilizzando lo stesso contenitore di cristallizzazione. Viene descritto anche il funzionamento dell'iniettore.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hen eggwhite lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicon grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector needle (108 &#181;m ID)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part No: 7803-05</td>
			<td>www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas-tight syringes, 100 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part no: 7656-01</td>
			<td>Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCP syringe coupler</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>209526</td>
			<td>Syringe coupler to mix the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidico injector</td>
			<td>La Trobe Univerity/ANSTO</td>
			<td></td>
			<td>This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron

Presso il sincrotrone australiano è stata sviluppata una struttura per l'esecuzione di misurazioni seriali della cristallografia. Questa struttura incorpora un iniettore ad alta viscosità appositamente costruito, Lipidico, come parte della linea di fascio di cristallografia macromolecolare (MX2) per misurare un gran numero di piccoli cristalli a temperatura ambiente. L'obiettivo di questa tecnica è quello di consentire la produzione/trasferimento di cristalli su siringhe di vetro da utilizzare direttamente nell'iniettore per la raccolta dei dati della cristallografia seriale. I vantaggi di questo iniettore includono la capacità di rispondere rapidamente alle variazioni della portata senza interruzione del flusso. Esistono diverse limitazioni per questo iniettore ad alta viscosità (HVI) che includono una restrizione sulle viscosità del campione consentite a >10 Pa.s. La stabilità del flusso può anche essere potenzialmente un problema a seconda delle proprietà specifiche del campione. Qui viene presentato un protocollo dettagliato su come impostare i campioni e utilizzare l'iniettore per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano. Il metodo dimostra la preparazione del campione, incluso il trasferimento di cristalli di glisozima in un supporto ad alta viscosità (grasso siliconico) e il funzionamento dell'iniettore per la raccolta dei dati a MX2.

Lipidico è un HVI costruito come sistema di erogazione alternativo per l'uso su MX2 (Figura 1). È ideale per SX dove i cristalli vengono coltivati in fase cubica lipidica o trasferiti su un supporto inerte ad alta viscosità.
Per dimostrare l'applicazione dell'iniettore è stato utilizzato grasso siliconico miscelato con cristalli di lisozima per raccogliere dati SX sulla linea di fascio MX2 presso il sincrotrone australiano. Per montare l'iniettore sulla linea ...

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Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare come preparare campioni di cristallografia seriale per la raccolta dei dati su un iniettore ad alto viscoso, Lipidico, recentemente commissionato al sincrotrone australiano.

Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.2K Views.  La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare come preparare campioni di cristallografia seriale per la raccolta dei dati su un iniettore ad alto viscoso, Lipidico, recentemente commissionato al sincrotrone australiano.

Video: Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Ricerca

Bioingegneria

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Sintesi di idrogel con proprietà antivegetative come membrane per la purificazione dell&#39;acqua

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Misure di potenza ingresso in bioreattori agitate a scala di laboratorio

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Iniezione delle nanoparticelle Retroductal alla ghiandola sottomandibolare murina

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

Sistema automatizzato di centrifuga controflusso per l'elaborazione di celle su piccola scala

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized matrix. This organization is challenging to replicate due to the heterogeneous environment of bone. Ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions (COBICS) is a microgel-based bioprinting technique that uniquely replicates the mineral and cellular structure of bone. COBICS prints complex, biologically relevant constructs without the need for sacrificial support materials or harsh postprocessing steps (e.g., radiation and high-temperature sintering), which are two of the biggest challenges in the additive manufacturing of bone mimetic constructs. This technique is enabled via the freeform extrusion of a novel calcium phosphate-based ink within a gelatin-based microgel suspension. The yield-stress properties of the suspension allow deposition and support the printed bone structure. UV crosslinking and nanoprecipitation then "lock" it in place. The ability to print nanostructured bone-mimetic ceramics within cell-laden biomaterials provides spatiotemporal control over macro- and micro-architecture and facilitates the real-time fabrication of complex bone constructs in clinical settings.

This protocol describes a 3D printing technique to fabricate bone-like structures by depositing a calcium phosphate ink in a gelatin-based granular support. Printed bone analogs are deposited in freeform, with flexibility for direct harvesting of the print or crosslinking within a living cell matrix for multiphasic constructs.

Bioprinting omnidirezionale ceramico in sospensioni caricate di cellule per la generazione di analoghi ossei

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a chemotherapeutic might be functionalized with an antibody to enhance binding to cancer cells (&#34;targeting&#34;) or functionalized with polyethylene glycol to help evade immune cell recognition (&#34;stealth&#34;). Even at a cellular level, optimizing the binding and uptake of a drug carrier is a complex biological design problem. Thus, it is valuable to separate how strongly a new carrier interacts with a cell from the functional efficacy of a carrier&#39;s cargo once delivered to that cell.
To continue the chemotherapeutic example, &#34;how well it binds to a cancer cell&#34; is a separate problem from &#34;how well it kills a cancer cell&#34;. Quantitative in vitro assays for the latter are well established and usually rely on measuring viability. However, most published research on cell-carrier interactions is qualitative or semiquantitative. Generally, these measurements rely on fluorescent labeling of the carrier and, consequently, report interactions with cells in relative or arbitrary units. However, this work can be standardized and be made absolutely quantitative with a small number of characterization experiments. Such absolute quantification is valuable, as it facilitates rational, inter- and intra-class comparisons of various drug delivery systems-nanoparticles, microparticles, viruses, antibody-drug conjugates, engineered therapeutic cells, or extracellular vesicles.
Furthermore, quantification is a prerequisite for subsequent meta-analyses or in silico modeling approaches. In this article, video guides, as well as a decision tree for how to achieve in vitro quantification for carrier drug delivery systems, are presented, which take into account differences in carrier size and labeling modality. Additionally, further considerations for the quantitative assessment of advanced drug delivery systems are discussed. This is intended to serve as a valuable resource to improve rational evaluation and design for the next generation of medicine.

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A workflow is demonstrated for the absolute quantification of drug carrier-cell interactions using flow cytometry to allow better rational evaluation of novel drug delivery systems. This workflow is applicable to drug carriers of any type.

Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Un nuovo metodo di iniezione lenta minimamente invasivo per ridurre le lesioni tissutali

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

Autore in primo piano: un nuovo metodo di iniezione cellulare con un'invasione minima  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Un nuovo metodo di iniezione cellulare con un'invasione minima

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...