Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi İleri Moleküler Görüntüleme Mükemmeliyet Merkezi (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma kısmen ANSTO'nun bir parçası olan Avustralya Senkrotron'daki MX2 kiriş çizgisi kullanılarak gerçekleştirildi ve Avustralya Kanser Araştırma Vakfı (ACRF) dedektöründen yararlanıldı.

1. Cam şırınnalar kullanılarak yüksek viskoziteli bir ortamda kristallerin hazırlanması
<ol><li>Yumuşak bir kristal pelet oluşturmak ve fazla tamponu çıkarmak için kristal çözeltisini hafifçe (~1.000 x g, 22 °C'de ~10 dk) santrifüjleyin. Bu, veri toplama için kullanılabilecek pelet içinde yüksek miktarda kristalle sonuçlanacaktır. NOT: Viskoz ortamın seyreltilmesini önlemek için bu adımda kristal konsantrasyonunu artırın. Ortam için yüksek viskoziteyi korurken yüksek miktarda kristal elde etmek için her örnek için viskoz ortamın kristal hacmine oranını optimize edin. Bir pelet oluşturmak için kristal çözeltiyi santrifüj edin ve Darmanin et'te açıklandığı gibi çözeltideki kristal konsantrasyonu artırmak için fazla tamponu çıkarın. al.29.</li>
	<li>Bir bağlayıcı ile iki adet 100 μL şırınna kurun.</li>
	<li>Bağlayıcıyı ilk şırınnanın sonuna sabitleyin ve şırınnanın üstüne 28 μL kristal çözelti ekleyin. Yavaşça, pistonu şırınnanın tepesine yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça bağlayıcı ucun sonuna doğru itin ve oluşan hava kabarcıklarını çıkarın. Bunu, aşağıda açıklanan iki yöntemden birini izleyerek yapın. NOT: Yüksek viskoz ortama eklenecek kristallerin hacmi, genel numunenin viskozitesini önemli ölçüde değiştirmezse değiştirilebilir.<ol>
<li>İlk yöntem: Hava kabarcıklarını patlatmak için hızlı basınç değişiklikleri kullanın.<ol>
<li>Eldivenli bir parmağı künt bağlayıcı iğne noktasının üstüne dikkatlice yerleştirin ve (çok nazikçe) bir conta oluşturmak için basınç uygulayın. İğne çubuğu yaralanmasına neden olabileceğinden çok fazla basınç uygulamayın.</li>
			<li>Şimdi çözeltiyi iğne noktasından uzaklaştırmak için pistonu geri çekin, bu şırıngada basınç birikmesine neden olacaktır.</li>
			<li>Eldivenli parmağı körelmiş iğne ucundan çıkararak şırınganın üstündeki basıncı hızla serbest bırakın. Dikkatli olun, parmak çıkarıldığında numune ucuna çok yakınsa, numune kaybına neden olabilir. Şırınd içindeki basınçtaki hızlı değişim hava kabarcıklarını patlatacaktır. Tüm kabarcıklar çıkarılana kadar tekrarlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İkinci yöntem: Hava kabarcıklarını gidermek için 'insan santrifüjü' kullanma.<ol>
<li>Şırıngayı bir elinizle iğne yukarı bakacak şekilde ve piston iki parmak arasına sıkışmış olacak şekilde yerleştirin, böylece hareket edemez.</li>
			<li>Şırınnayı bir yönde tutan kolu 2-3 kez hızlı bir şekilde döndürün, numunedeki santrifüj kuvveti şırınnadan herhangi bir hava kabarcığı çıkmaya zorlayacaktır. Dikkatli olun, çok yavaş yapılırsa örnek kaybolabilir.</li>
			<li>Şırındıcı hava kabarcıkları için inceleyin, kabarcıklar kalırsa, tüm hava kabarcıkları çıkarılana kadar 1.3.2.1 – 1.3.2.2 adımlarını tekrarlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>İnce bir spatula kullanarak, ~42 μL yüksek vakumlu silikon gresi doğrudan ikinci şırınnanın üstüne ekleyin. Pistonu sonuna kadar itin, tüm hava kabarcıklarını çıkarın ve şırınnanın ucunda hava boşluğu olmadığından emin olun. NOT: Silikon gresinin hassas bileşimi, atıl bir taşıyıcı görevi göremediği için kritik değildir. >10 Pa.s viskozite değeri veya kristal çözeltiye yaklaşık 60:40 silikon gres oranı enjeksiyon için en uygunudur, ancak bu numunenin kesin özelliklerine bağlı olarak değişebilir. Tartışmada belirtildiği gibi, karışımdaki kristal konsantrasyonunu optimize etmek için silikon grese eklenen kristal çözeltisinin hacmini ayarlayın. Silikon gres dışındaki yüksek viskozortamlar, örnek 30 , 31 , 32,33ile uyumlu oldukları sürecekullanılabilir.</li>
	<li>İki şırınnada da hava kabarcığı olmadığından emin olun ve şırınnaları bağlayıcıyı kullanarak birbirine takın. Parmaklardan oluşan ısı nedeniyle şırınnanın ısınması numuneyi etkileyebileceğinden şırınnanın sadece ucunu kavrayarak şırınnaları dikey olarak tutun.</li>
	<li>Kristal çözelti tarafındaki pistonu hafifçe bastırarak numuneyi karıştırın, böylece silikon grese karışır ve ardından pistonu silikon gres tarafına iter, böylece numuneyi kristal çözelti tarafına doğru geri iter. Hafifçe, bu işlemi 50 ila 100 kez tekrarlayın, böylece numune iyice karıştırılır ve homojengörünür. NOT: Kristaller doğrudan yüksek viskoziteli ortamda yetiştirilirse (örneğin, lipidik kübik faz, LCP), 1.1–1.6 adımları gerekli değildir. Şırındlar içinde kristal yetiştirmek için protokoller Liu et.al bulunabilir. 34,35. Bu iletişim kuralını, tüm örneğin artık tek bir şırınnada bulunduğu ve kristalizasyon arabelleği kaldırıldığı örnek konsolidasyon, adım 10'a kadar izleyin. Bu protokol için 7.9MAG eklenmesi gerekli değildir. Bunun yerine, şırınnada daha fazla sıvı kalmayana kadar pistonu numunede hafifçe aşağı iterek şırınnadan tüm fazla sıvıyı çıkarın.</li>
	<li>Kristalleri şırıngadan optik mikroskop altında görselleştirin veya en iyi sonuçlar için cam bir kaydırağa az miktarda (~1 μL) çıkarın ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin.</li>
	<li>Kristal konsantrasyonuna bak.<ol>
<li>Optik mikroskop görüntülerini kullanarak belirli bir alandaki kristal sayısını sayarak silikon gresteki kristal konsantrasyonunu belirleyin. En iyi sonuçlar için, medya boyunca eşit olarak dağıtılan yüksek kristal yoğunluğu, yüksek kristal isabet oranı elde etmek için idealdir (>106 kristal/mL).</li>
		<li>1.3 ve 1.4 adımlarında kristallerin viskoz ortama oranını değiştirerek şırınnadaki kristal konsantrasyonu ayarlayın.<ol>
<li>Kristal konsantrasyonunu azaltmak için, adım 1.4'te silikon gres /HV ortamı miktarını artırarak veya şırıngları 1.1 adımda kurmadan önce kristal peletin kristalizasyon tamponu ile seyrelterek şırınnadaki kristalleri seyreltin.</li>
			<li>Kristal konsantrasyonunu artırmak için, adım 1.4'te silikon gres miktarını azaltın, ancak viskoziteyi 10 Pa'nın altına düşürmemeye dikkat edin. NOT: Burada bildirilen kristal konsantrasyonu bu özel numune ve kristal boyutu için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, ideal kristal konsantrasyonu kristal boyutuna, ışın boyutuna, iğne İç Çapına (I.D.) ve olay X-ışını akısına bağlı olacaktır. Bu, 'iyi' olarak kabul edilen ~%30'luk optimum isabet oranıyla isabet oranından belirlenebilir. Uygulamada, kristal konsantrasyonu istenen isabet oranını elde etmek için ışın süresi boyunca farklı numuneler için optimize edilmelidir. Yüksek kristal konsantrasyonu ile başlayın, 109 kristal / mL. Kristal konsantrasyonu ayarlama prosedürü Liu et.al verilir. 35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İletişim kuralı, enjektör veri toplamaya hazır olana kadar burada duraklatılabilir.<ol>
<li>Kristaller LCP'de yetiştirilirse, onları kapatın ve oda sıcaklığında birkaç güne kadar şırındaklarda kalmasına izin verin.</li>
			<li>Kristaller farklı bir yüksek viskoz ortama (örneğin silikon gres) aktarılmışsa, ölçümden önce kristallerin zaman içinde stabilite testi yapılmalıdır. Bu, kristallerin inert ortamda ne kadar süre kararlı olduğunu (ideal olarak > 8 h) ve veri toplama zaman sınırını belirler. Burada, lysozyme kristalleri silikon greste günlerce stabildi ve optik mikroskop kullanılarak incelendiğinde çözülme belirtileri göstermedi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bağlayıcının bağlantısını kesmeden önce tüm örneği tek bir şırınna taşıyın. Bağlayıcıyı şırıngadan çıkarın ve enjeksiyon iğnesini takın. İğneyi şırınganın tabanına sıkıca vidaleyin ve herhangi bir sızıntıyı önlemek için sıkıca tutturulmasını sağlayın. Bu deney için 108 μm I.D. iğne (iğne uzunluğu 13 mm, nokta stili 3) kullanılmıştır. Kristal boyutuna ve kiriş boyutuna bağlı olarak 51 μm veya 108 μm I.D. iğnesi takın. NOT: Doğru enjektör iğne boyutunu seçebilmek için ışınlama süresinden önce numune akışının ön test edilmesi gerekir. Numune özelliklerine (viskozite, şarj, tampon bileşimi) ve iğne kimliğine bağlı olarak, numuneler farklı akacaktır. Bu nedenle, veri toplama sırasında sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için mümkün olan en küçük kimlik iğnesi ile en kararlı akışı üretmek için çeşitli iğne boyutlarının test etmesi önerilir.</li>
	<li>Enjektör zaten monte edilmiş ve ışın hattına hizalanmışsa, bölüm 3'e geçin ve numune şırınnasını doğrudan enjektöre monte edin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>2. Enjektör montajı ve kontrolü
<ol><li>Enjektörü kiriş çizgisine monte edin. MX2 kiriş hattındaki kriyojenik nozülü çıkarın ve enjektörle değiştirdi. Kriyojenik nozüle tutan sıkma vidasını gevşetin ve motorlu sahnenin yanında bulunan brakete takın.</li>
	<li>Siyah sapı tutarak enjektörü arabasından yukarı kaldırın ve motorlu sahneye yerleştirin.<ol>
<li>Enjektörü motorlu aşamaya sabitlemek için; siyah sıkma vidalı düğmeyi elle sıkın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjektöre boş bir şırınna monte edin<ol>
<li>Enjektör bilgisayar kontrol arabiriminde (örneğin, EPOS konum kontrol yazılımı), yazılım menüsündeki Araçlar'ın altında Homing Modu'nu seçin. Ardından Negatif Sınır Anahtarı'nı seçin ve Homing'i başlatın, şırınnanın vidanın altına sığmasını sağlamak için vida yeterince çekilene kadar yazılımın çalışmasına izin verin. Denetimsiz çalışacak şekilde bırakılırsa, limit anahtarı vidayı otomatik olarak durdurur.</li>
		<li>İğneyi şırınga tutucusundaki yarıktan geçirerek enjektöre boş ('kukla') bir şırınga takın. Şırındıcı brakete hizala.</li>
		<li>Şırınnayı iki O halkası ile sabitleyin.<ol>
<li>İlk O-halkayı şırınnanın orta bölümüne sarın ve şırınnanın her iki tarafındaki kancalara takın.</li>
			<li>İkinci O-halkayı şırınnanın üst kısmındaki kancaların etrafına dola ve ardından O halkasının bir parçasını gösteride ve Şekil 1B'degösterildiği gibi cam şırınnanın üstüne koyun.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjektörü X-ışını ışınlarına hizalayın<ol>
<li>Enjektör ile motorlu aşamayı beamline kontrol yazılımı aracılığıyla X-ışını etkileşim noktasına doğru hareket ettirin. Bu, satır içi kamera kullanılarak görselleştirilebilir. Işın boyutu ve konumu ekrandaki kırmızı bir haçla gösterilir ve motorlu aşama iğneyi X-ışını etkileşim bölgesiyle hizalamak için hareket ettirilebilir.</li>
		<li>İğneyi kırmızı haçla hizalamak için sahnenin x ve y konumunu ayarlayın.</li>
		<li>İğne ucu netleme gelene kadar z pozisyonunu ayarlayın.</li>
		<li>Şırınga ucunun, ışın çizgisi kamerası tarafından oluşturulan optik mikroskop görüntüsünde görülebilen nişangahlarla bir araya gelip gelmediğini kontrol ederek iğne ucunun ve X-ışını ışınının hizalamasını görsel olarak doğrulayın.</li>
		<li>İğne ucu hizalandıktan sonra ucu çapraz kılların üzerine ~100 μm hareket ettinin. Bu, iğne ucundaki x-ışını saçılmasını ortadan kaldırır. NOT: Enjektörün senkrotrondaki MX2 kiriş çizgisine monte edilmesi ve hizalaması, ışın çizgisi bilim adamları tarafından yapılmalıdır ve 30 dakikadan daha kısa bir sürede tamamlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Numune şırındıcının montajı
<ol><li>2.3 adımını izleyerek boş şırınnayı örnek şırınna ile değiştirin.</li>
	<li>Enjektör kapağını örnek şırınna piston başlığına yerleştirin.</li>
	<li>Sürücü vidasını kapağın üstüne taşıyın.</li>
	<li>Enjektör kontrol yazılımında Hız Modu 'nuseçin.</li>
	<li>Ayar Değeri olarak 3000 rpm (~115 nL/s) girin ve Ayar Değeri Uygula 'yabasın.</li>
	<li>Tahrik vidası şırınna piston başlığının kapağına dokunduğunda motoru durdurun.<ol>
<li>Vida kapağa yaklaşırken Ayar Değerini '0' olarak değiştirerek enjektör kontrol yazılımında rpm değerini sıfır olarak ayarlayın.</li>
		<li>Temas kurulduktan sonra, vidayı anında durdurmak için Ayar Değeri Uygula'ya basarak önceden ayarlanmış değeri etkinleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıkıca yerinde tutulduğundan emin olmak için kapağı hafifçe oynatın. NOT: Denetim yazılımındaki Ayar Değeri kutusuna yeni bir ayar değeri girildiğinde, yalnızca Ayar Değeri Uygula 'yabasıldıktan sonra etkinleştirilir.</li>
</ol>4. Enjektörü çalıştırma
<ol><li>Kapak tahrik vidası pistonun üst kısmıyla sıkı temas ettikten sonra rpm Ayar Değerini 100 olarak değiştirin. Bu ~ 4 nL/s'ye eşdeğerdir.</li>
	<li>Numune ilk çıktığında iğne ucunu görsel olarak inceleyin veya numunenin iğne ucundan ne zaman ekstrüde olmaya başladığını gözlemlemek için iğnenin beamline kamera görüntüsüne bakın.</li>
	<li>Mandalı arayın, hutch kapısını kapatın ve X-ışını ışınını açın. Bu noktadan itibaren enjektör hutch dışından uzaktan çalıştırılmalıdır.</li>
	<li>Kararlı bir akış oluşturulana kadar rpm'i ayarlayın.<ol>
<li>rpm Ayar Değerini 90'a düşür.</li>
		<li>Akışı yavaşlatmak, ancak yine de kararlı bir akış sağlamak için rpm Ayar Değerini 10'luk artışlarla azaltarak 4.4.1 adımını yineleyin. Silikon gres için 30 rpm değeri kullanılmıştır. NOT: Tipik rpm aralığı, numune özelliklerine ve X-ışını maruz kalma süresine bağlı olarak 30 – 100 rpm (1 – 4 nL/s) arasında değişir. Genel olarak, rpm kararlı bir akış korurken en yavaş akış hızını (numune tüketimini en aza indirmek için) üretecek şekilde ayarlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İyi akmayan bir örnek akışı yönetme.<ol>
<li>Akış düzleşene kadar rpm Ayar Değerini 10'un artışlarıyla artırmaya devam edin. Akış sabitlenmezse, rpm Ayar Değeri'ni en fazla 100 rpm değerine yükselttikten sonra bile, aşağıda açıklanan iki yöntemden birini uygulayarak kararlılığı artırmaya çalışın.<ol>
<li>İlk yöntem: Numuneyi yönlendirmeye yardımcı olmak için numune akışının altına bir polistiren örnek yakalayıcı yerleştirin. Bu yöntem, yüksek yüklü örnek akışlar için iyi çalışır.</li>
			<li>İkinci yöntem: Örnek yakalayıcıya bir venturi emiş hunisi yerleştirin. Huniye hava sağlamak için, hutch'ta bulunan hava çıkış tüpüne bağlayın. Bu yöntem, akışın yükünden bağımsız olarak numune akışının yönlendirlenmesine ve stabilizelenmesine yardımcı olabilir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sabit ve sabit bir akış elde edildikten sonra, veri toplamaya başlayın ve dedektör mesafesini normal bir X-ışını kristalografisi deneyine göre optimize edin. NOT: Rpm, 'Lipidico Cihaz Hesaplayıcısı' Ek Bilgileri'nde sağlanan dönüştürme tablosu kullanılarak akış hızına dönüştürülür. Bu hesap makinesini kullanarak akış hızını hesaplamak için rpm değerini, iğne çaplarını ve şırınga hacimlerini girin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boutet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+protein+structure+determination+by+serial+femtosecond+crystallography.">High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography.</a> Science. 337 (6092), 362-364 (2012).</li><li>Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+lasers+for+structural+and+dynamic+biology.">X-ray lasers for structural and dynamic biology.</a> Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).</li><li>Aquila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+protein+nanocrystallography+using+an+X-ray+free-electron+laser.">Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser.</a> Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nylon+mesh-based+sample+holder+for+fixed-target+serial+femtosecond+crystallography.">Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 9, 6971 (2019).</li><li>Martin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+X-ray+diffraction+reveals+three-dimensional+nanostructure+and+disorder+in+self-assembled+lipid+phases.">Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases.</a> Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).</li><li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+fixed-target+serial+virus+crystallography.">High-speed fixed-target serial virus crystallography.</a> Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).</li><li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography.">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nature Communications. 5, 3309 (2014).</li><li>Weierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography.">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser.">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li><li>Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+delivery+media+for+serial+crystallography.">Sample delivery media for serial crystallography.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).</li><li>Batyuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+phasing+of+x-ray+free-electron+laser+data+for+a+G+protein-coupled+receptor.">Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor.</a> Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).</li><li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+intermediates+of+Kok's+photosynthetic+water+oxidation+clock.">Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock.</a> Nature. 563 (7731), 421 (2018).</li><li>Suga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxyl/oxo+mechanism+for+oxygen-oxygen+coupling+in+PSII+revealed+by+an+x-ray+free-electron+laser.">An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser.</a> Science. 366 (6463), 334-338 (2019).</li><li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein.">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li><li>Pande, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+structural+dynamics+drives+the+trans/cis+isomerization+in+photoactive+yellow+protein.">Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein.</a> Science. 352 (6286), 725-729 (2016).</li><li>Ishigami, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshot+of+an+oxygen+intermediate+in+the+catalytic+reaction+of+cytochrome+c+oxidase.">Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).</li><li>Nango, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+movie+of+structural+changes+in+bacteriorhodopsin.">A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin.</a> Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+isomerization+in+bacteriorhodopsin+captured+by+a+femtosecond+x-ray+laser.">Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser.</a> Science. 361 (6398), (2018).</li><li>Martin-Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+millisecond+crystallography+of+membrane+and+soluble+protein+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).</li><li>Berntsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+millisecond+crystallography+instrument+at+the+Australian+Synchrotron+incorporating+the+"Lipidico"+injector.">The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector.</a> Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).</li><li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams.">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).</li><li>DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N., Tschentscher, T., Cocco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+injection+for+pulsed+X-ray+sources.">Sample injection for pulsed X-ray sources.</a> Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. , 8078 (2011).</li><li>Park, S. Y., Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+delivery+using+viscous+media,+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography.">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li><li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure.">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li><li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography.">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li><li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography.">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345 (2016).</li><li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography.">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography.">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484 (2016).</li><li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase.">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li><li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography.">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).</li><li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography.">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li><li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography.">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li><li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science:+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art.">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li></ol>

MK, Kusel tasarımları için çalışır. Özel bir laboratuvar cihaz geliştiricisi olan Kusel Design, La Trobe Üniversitesi'nden Dr. Peter Bentsen ve ANSTO'dan Dr Tom Caradoc-Davies tarafından Avustralya Senkrotron'daki MX2 ışın hattında yüksek viskoz çalışmalara olanak sağlayacak düşük maliyetli bir cihaz geliştirmekle meşgul oldu. Cihaz, Dr. Caradoc-Davies ile yakın istişare içinde geliştirildi. Yazarların rakip finansal çıkarları yoktur.

Senkrotron kaynaklarında SX deneyleri yapmak için ideal olan alternatif bir HVI geliştirilmiştir. Mevcut HVI'lere göre iki temel avantajı vardır. İlk olarak, geleneksel kristalografi ve SX arasında hızlı geçiş sağlayan kiriş çizgisine kurulumu kolaydır, MX2'ye kurulum ve hizalama için sadece ~ 30 dakika gereklidir. İkincisi, kristal yetiştirmek için kullanılan örnek şırınnalar, numune transferi sırasında wastage'ı sınırlayarak enjeksiyon için rezervuar olarak doğrudan kullanılabilir. Ör...

Seri kristalografi (SX), başlangıçta X-ışını Serbest Elektron Lazerleri (XFEL'ler) 1, 2,3,4bağlamında geliştirilen bir tekniktir. Sabit hedef yaklaşımları SX5,6,7için kullanılabilse de, tipik olarak, kristalleri X-ışını ışınlarına sürekli bir akışta teslim etmek için enjektör sistemleri kullanılır. Çok sayıda kristalden gelen verileri birleştirdiği için, SX deney sırasında herhangi bir kristal hizalama ihtiyacını önler ve verilerin odasıcaklığında 8,9. Uygun bir enjektör yardımıyla, kristaller X-ışını etkileşim alanına tek tek akar ve elde edilen kırınım verileri bir alan dedektörü9,10'da toplanır. Bugüne kadar SX, geleneksel kristalografi kullanarak ölçülemeyecek kadar küçük kristaller de dahil olmak üzere1,11,12,13 protein yapılarını çözmede başarılı olmuştur. Ayrıca XFEL'in femtosaniye darbe süresinden yararlanarak zaman çözülen moleküler dinamikler hakkında yeni içgörüler sağlamıştır. Optik lazer kaynakları ile pompa probu reaksiyonları başlatılarak fotosistem II14 , 15, fotoaktif sarı protein16,17,sitokrom Coksidaz18 ve bakteriyhodopsin19,20,21üzerinde derinlemesine çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalar, zaman ile çözülen biyolojik süreçleri anlamak için seri kristalografinin önemli potansiyelini gösteren ışık aktivasyonundan sonra ortaya çıkan elektron transfer dinamiklerini araştırmıştır.
Seri kristalografinin gelişimi de senkrotron kaynakları 9 , 12,20,22,23,24'tegiderek yaygınlaşmaktadır. Senkrotron bazlı SX, çok sayıda bireysel kristalin uygun bir enjektör sistemi kullanılarak oda sıcaklığında verimli bir şekilde ölçülmasını sağlar. Bu yaklaşım daha küçük kristaller için uygundur, bu nedenle verileri toplamak için hızlı bir kare hızı dedektörü gerektirmenin yanı sıra, mikro odaklı bir ışın da gereklidir. Geleneksel kristalografi ile karşılaştırıldığında, SX, X-ışını ışınındaki tek tek kristallerin montajını ve hizalamasını içermez. Çok sayıda bireysel kristalden elde edilen veriler birleştirildiğinden, her kristal tarafından alınan radyasyon dozu geleneksel kristalografiye kıyasla önemli ölçüde azaltılabilir. Synchrotron SX, yeterince yüksek kare hızına sahip bir dedektörün mevcut olması koşuluyla (örneğin, 100 Hz veya daha fazla) milisaniyelik rejime kadar zaman çözümlenmiş reaksiyonların incelenmesine de uygulanabilir. Başlangıçta XFEL kaynakları 20,22,23'tegeliştirilen enjektörlerkullanılarak senkrotronda çeşitli seri kristalografi deneyleri yapılmıştır. En yaygın iki enjektör türü Gaz Dinamik Sanal Nozül (GDVN)25 ve Yüksek Viskoz Enjektör (HVI)9, 24,26,27,28 'dir. GDVN, düşük viskoziteli, sıvı numuneler enjekte etmek için idealdir, ancak kararlı akışlara ulaşmak için yüksek akış hızları gerektirir ve bu da yüksek numune tüketim oranlarına yol açar. Bunun aksine, HVI'ler çok daha düşük akış hızlarında kararlı bir akış üretilmesine izin veren ve çok daha düşük numune tüketimine yol açan yüksek viskoziteli numuneler için uygundur. Bu nedenle, HVI enjektörü, viskoz bir taşıyıcının tercih edildiği (örneğin, membran proteinleri için lipid bazlı) ve / veya büyük miktarlarda numunenin bulunmadığı numunelerin teslimini tercih eder. SX enjektörlerinin kullanımı genellikle zordur ve çalışması için kapsamlı eğitim gerektirir. Ayrıca, numunenin özel bir rezervuara yüklenmesi gerektiğinden, uzun numune aktarım protokollerini de içerirler, bu genellikle numunenin 'ölü hacimde' veya bağlantılardaki sızıntılar yoluyla kaybolmasıyla ilişkili yüksek bir riske sahiptir. Bu nedenle, numune X-ışını ışınlarına ulaşmadan önce herhangi bir kaybı azaltmak için enjektör tasarımını optimize etmek istenir.
Son zamanlarda, ilk SX sonuçları Lipidico23 kullanılarak bir lysozyme hedefi kullanılarak, bir Eiger 16M dedektörü kullanılarak yayınlandı. Bu enjektör tasarımı, ilk kristalizasyondan kristallerin enjektöre aktarılmasına ve ardından numunenin X-ışını ışınına teslim edilmesine kadar olan adımların sayısını en aza indirerek örnek atıklarını sınırlar. Bu makale, aynı kristalizasyon kabını kullanarak numune hazırlamadan başlayarak, enjeksiyon sürecine ve son olarak veri toplama işleminden başlayarak örnek aktarım prosedürünü açıklar ve gösterir. Enjektörün çalışması da açıklanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hen eggwhite lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicon grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector needle (108 &#181;m ID)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part No: 7803-05</td>
			<td>www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas-tight syringes, 100 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part no: 7656-01</td>
			<td>Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCP syringe coupler</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>209526</td>
			<td>Syringe coupler to mix the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidico injector</td>
			<td>La Trobe Univerity/ANSTO</td>
			<td></td>
			<td>This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron

Avustralya senkrotron'larında seri kristalografi ölçümleri yapmak için bir tesis geliştirilmiştir. Bu tesis, oda sıcaklığında çok sayıda küçük kristali ölçmek için makromoleküler kristalografi (MX2) kiriş hattının bir parçası olarak yüksek viskoz enjektör Lipidico'yu içerir. Bu tekniğin amacı, kristallerin seri kristalografi veri toplama için doğrudan enjektörde kullanılmak üzere cam şırınna yetiştirilmesini/aktarılmasını sağlamaktır. Bu enjektörün avantajları, akış hızının kesintiye uğramadan akış hızındaki değişikliklere hızlı bir şekilde yanıt verebilmesidir. Bu yüksek viskoziteli enjektör (HVI) için izin verilen örnek viskozitelerinin >10 Pa.s.'a sınırlandırılmasını içeren çeşitli sınırlamalar vardır. Akış kararlılığı, örneğin belirli özelliklerine bağlı olarak potansiyel olarak bir sorun olabilir. Avustralya senkrotron'larında seri kristalografi ölçümleri için numunelerin nasıl ayarlanıp enjektörün nasıl çalıştırılacağına ilişkin ayrıntılı bir protokol burada sunulmaktadır. Yöntem, lysozyme kristallerinin yüksek viskoz bir ortama (silikon gres) aktarılması ve enjektörün MX2'de veri toplama için çalışması da dahil olmak üzere numunenin hazırlanmasını göstermektedir.

Lipidico, MX2'de kullanılmak üzere alternatif bir teslimat sistemi olarak inşa edilmiş bir HVI'dir (Şekil 1). Kristallerin lipidik kübik fazda yetiştirildiği veya yüksek viskoz inert ortama aktarıldığı SX için idealdir.
Enjektör uygulamasını göstermek için, Avustralya senkrotronundaki MX2 kiriş hattında SX verilerini toplamak için lysozyme kristalleri ile karıştırılmış silikon gres kullanıldı. Enjektörü MX2 kiriş çizgisine monte e...

Watch this Scientific Journal Video about Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron at JoVE.com

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Bu protokolün amacı, yakın zamanda Avustralya senkrotronunda görevlendirilen yüksek viskoz enjektör Lipidico'da veri toplama için seri kristalografi örneklerinin nasıl hazırlanacağını göstermektir.

Avustralya Senkrotron'da Seri Kristalografi Ölçümleri için Lipidico Enjeksiyon Protokolü

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.2K Görüntüleme.  La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086. Bu protokolün amacı, yakın zamanda Avustralya senkrotronunda görevlendirilen yüksek viskoz enjektör Lipidico'da veri toplama için seri kristalografi örneklerinin nasıl hazırlanacağını göstermektir.

Video: Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Biyomühendislik

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Su Arıtma Membranlar olarak Zehirli Özelliklere Sahip Hidrojeller Sentezi

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Laboratuvar ölçekte karıştırılmış Biyoreaktörler güç giriş ölçümlerde

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Fare Submandibular bezi Retroductal nanopartikül enjeksiyon

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

Küçük Ölçekli Hücre İşleme için Otomatik Karşı Akım Santrifüj Sistemi

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized matrix. This organization is challenging to replicate due to the heterogeneous environment of bone. Ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions (COBICS) is a microgel-based bioprinting technique that uniquely replicates the mineral and cellular structure of bone. COBICS prints complex, biologically relevant constructs without the need for sacrificial support materials or harsh postprocessing steps (e.g., radiation and high-temperature sintering), which are two of the biggest challenges in the additive manufacturing of bone mimetic constructs. This technique is enabled via the freeform extrusion of a novel calcium phosphate-based ink within a gelatin-based microgel suspension. The yield-stress properties of the suspension allow deposition and support the printed bone structure. UV crosslinking and nanoprecipitation then "lock" it in place. The ability to print nanostructured bone-mimetic ceramics within cell-laden biomaterials provides spatiotemporal control over macro- and micro-architecture and facilitates the real-time fabrication of complex bone constructs in clinical settings.

This protocol describes a 3D printing technique to fabricate bone-like structures by depositing a calcium phosphate ink in a gelatin-based granular support. Printed bone analogs are deposited in freeform, with flexibility for direct harvesting of the print or crosslinking within a living cell matrix for multiphasic constructs.

Kemik Analoglarının Üretimi için Hücre Yüklü Süspansiyonlarda Seramik Çok Yönlü Biyobaskı

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a chemotherapeutic might be functionalized with an antibody to enhance binding to cancer cells (&#34;targeting&#34;) or functionalized with polyethylene glycol to help evade immune cell recognition (&#34;stealth&#34;). Even at a cellular level, optimizing the binding and uptake of a drug carrier is a complex biological design problem. Thus, it is valuable to separate how strongly a new carrier interacts with a cell from the functional efficacy of a carrier&#39;s cargo once delivered to that cell.
To continue the chemotherapeutic example, &#34;how well it binds to a cancer cell&#34; is a separate problem from &#34;how well it kills a cancer cell&#34;. Quantitative in vitro assays for the latter are well established and usually rely on measuring viability. However, most published research on cell-carrier interactions is qualitative or semiquantitative. Generally, these measurements rely on fluorescent labeling of the carrier and, consequently, report interactions with cells in relative or arbitrary units. However, this work can be standardized and be made absolutely quantitative with a small number of characterization experiments. Such absolute quantification is valuable, as it facilitates rational, inter- and intra-class comparisons of various drug delivery systems-nanoparticles, microparticles, viruses, antibody-drug conjugates, engineered therapeutic cells, or extracellular vesicles.
Furthermore, quantification is a prerequisite for subsequent meta-analyses or in silico modeling approaches. In this article, video guides, as well as a decision tree for how to achieve in vitro quantification for carrier drug delivery systems, are presented, which take into account differences in carrier size and labeling modality. Additionally, further considerations for the quantitative assessment of advanced drug delivery systems are discussed. This is intended to serve as a valuable resource to improve rational evaluation and design for the next generation of medicine.

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A workflow is demonstrated for the absolute quantification of drug carrier-cell interactions using flow cytometry to allow better rational evaluation of novel drug delivery systems. This workflow is applicable to drug carriers of any type.

İlaç Dağıtım Sistemleri ve Hücreler Arasındaki Etkileşimlerin Deneysel Ölçümü In Vitro: Preklinik Nanotıp Değerlendirmesi İçin Bir Kılavuz

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Doku hasarını azaltmak için yeni bir minimal invaziv yavaş enjeksiyon yöntemi

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

Yazar Spotlight: Minimum İstila ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Minimum İnvazyon ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...