Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Esta pesquisa foi realizada em parte usando a linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano, parte do ANSTO, e fez uso do detector da Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

1. Preparação de cristais em uma mídia viscosa alta usando seringas de vidro
<ol><li>Centrifugar a solução de cristal suavemente (~1.000 x g, ~10 min a 22 °C) para formar uma pelota de cristal macio e remover o excesso de tampão. Isso resultará em uma alta concentração de cristais na pelota que podem ser usados para coleta de dados. NOTA: Para evitar a diluição da mídia viscosa aumente a concentração de cristal nesta etapa. Otimize a proporção de mídia viscosa ao volume de cristal para cada amostra para obter uma alta concentração de cristais, mantendo uma alta viscosidade para a mídia. Centrifugar a solução de cristal para formar uma pelota e remover o excesso de tampão para aumentar a concentração de cristal na solução, como descrito em Darmanin et. al.29.</li>
	<li>Configure duas seringas de 100 μL com um acotodo.</li>
	<li>Aperte o acostreiro até o final da primeira seringa e adicione 28 μL de solução cristalina ao topo da seringa. Lentamente, insira o êmbolo na parte superior da seringa e empurre suavemente a solução até o final da ponta do acoocoplador, removendo quaisquer bolhas de ar que se formam. Faça isso seguindo um dos dois métodos discutidos abaixo. NOTA: O volume de cristais a serem adicionados à mídia viscosa alta pode ser variado se não alterar significativamente a viscosidade da amostra geral.<ol>
<li>Primeiro método: Use mudanças rápidas de pressão para estourar as bolhas de ar.<ol>
<li>Coloque cuidadosamente um dedo enluvado na parte superior do ponto de agulha acotodo e (muito suavemente) aplique pressão para criar uma vedação. Não aplique muita pressão, pois isso pode resultar em uma lesão na agulha.</li>
			<li>Agora puxe o êmbolo de volta para afastar a solução do ponto da agulha, isso vai gerar um acúmulo de pressão na seringa.</li>
			<li>Solte rapidamente a pressão na parte superior da seringa removendo o dedo enluvado da ponta da agulha. Tenha cuidado, se a amostra estiver muito perto da ponta quando o dedo for removido, pode pulverizar, resultando na perda da amostra. A rápida mudança de pressão dentro da seringa vai estourar as bolhas de ar. Repita até que todas as bolhas tenham sido removidas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segundo método: Usar a "centrífuga humana" para remover bolhas de ar.<ol>
<li>Coloque a seringa em uma mão com a agulha voltada para cima e o êmbolo preso entre dois dedos, de modo que não possa se mover.</li>
			<li>Gire rapidamente o braço segurando a seringa em uma direção 2-3 vezes, a força centrífuga resultante na amostra forçará qualquer bolha de ar para fora da seringa. Tenha cuidado, se for feita muito lentamente a amostra pode ser perdida.</li>
			<li>Inspecione a seringa em busca de bolhas de ar, se as bolhas permanecerem, repita as etapas 1.3.2.1 – 1.3.2.2 até que todas as bolhas de ar sejam removidas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Com uma espátula fina, adicione ~42 μL de graxa de silicone de alto vácuo diretamente ao topo da segunda seringa. Empurre o êmbolo até o fim, removendo todas as bolhas de ar e garantindo que não haja abertura de ar no final da seringa. NOTA: A composição precisa da graxa de silicone não é crítica, pois está agindo como um portador inerte. Um valor de viscosidade de >10 Pa.s ou razão de aproximadamente 60:40 graxa de silicone para solução de cristal é ideal para injeção, no entanto, é possível que isso possa variar dependendo das características exatas da amostra. Ajuste o volume da solução cristalina adicionada à graxa de silicone para otimizar a concentração de cristal na mistura, conforme descrito na discussão. A mídia de alta viscosidade que não a graxa de silicone pode ser usada desde que sejam compatíveis com a amostra30,31,32,33.</li>
	<li>Certifique-se de que não há bolhas de ar em nenhuma das duas seringas e conecte as seringas juntas usando o acoedador. Segure as seringas verticalmente, agarrando apenas a extremidade da seringa, pois o aquecimento da seringa devido ao calor gerado pelos dedos pode afetar a amostra.</li>
	<li>Misture a amostra deprimindo suavemente o êmbolo do lado da solução de cristal para que se misture na graxa de silicone e, em seguida, empurre o êmbolo no lado da graxa de silicone, de modo que ele empurre a amostra de volta para o lado da solução de cristal. Suavemente, repita este processo 50 a 100 vezes para que a amostra seja completamente misturada e pareça homogênea. NOTA: Se os cristais forem cultivados diretamente em mídia altamente viscosa (por exemplo, fase cúbica lipídica, LCP), as etapas 1.1-1.6 não são necessárias. Protocolos para o cultivo de cristais dentro das seringas podem ser encontrados em Liu et.al. 34,35. Siga este protocolo até a consolidação da amostra, etapa 10, onde toda a amostra está agora contida em uma seringa e o tampão de cristalização é removido. A adição de 7.9MAG não é necessária para este protocolo. Em vez disso, remova todo o excesso de líquido da seringa empurrando suavemente o êmbolo para baixo na amostra até que não haja mais líquido na seringa.</li>
	<li>Visualize os cristais sob um microscópio óptico através da seringa ou, para obter melhores resultados, extraia uma pequena quantidade (~1 μL) em um slide de vidro e coloque um deslizamento de tampa na parte superior.</li>
	<li>Verifique a concentração de cristal.<ol>
<li>Determine a concentração de cristal na graxa de silicone contando o número de cristais em uma área específica usando as imagens do microscópio óptico. Para obter melhores resultados, uma alta densidade de cristais uniformemente dispensados em toda a mídia é ideal (>106 cristais/mL) a fim de obter uma alta taxa de acerto de cristal.</li>
		<li>Ajuste a concentração de cristal na seringa alterando a proporção de cristais para mídia viscosa nas etapas 1.3 e 1.4.<ol>
<li>Para diminuir a concentração de cristal, dilui os cristais na seringa aumentando a quantidade de graxa de silicone/mídia HV na etapa 1.4 ou diluindo a pelota de cristal em solução com o tampão de cristalização antes de configurar as seringas na etapa 1.1.</li>
			<li>Para aumentar a concentração de cristal, diminua a quantidade de graxa de silicone na etapa 1.4, mas tenha em atenção para não reduzir a viscosidade abaixo de 10 Pa.s. NOTA: A concentração de cristal relatada aqui foi otimizada para esta amostra específica e tamanho de cristal. No entanto, a concentração ideal de cristal dependerá do tamanho do cristal, do tamanho do feixe, do diâmetro interno da agulha (I.D.), e do fluxo de raios-X incidentes. Isso pode ser determinado a partir da taxa de acerto com uma taxa de acerto ideal de ~30% considerada como 'boa'. Na prática, a concentração de cristal deve ser otimizada para diferentes amostras durante o tempo do feixe para obter a taxa de acerto desejada. Comece com uma alta concentração de cristais, 109 cristais/mL. O procedimento para ajustar a concentração de cristal é dado em Liu et.al. 35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>O protocolo pode ser pausado aqui até que o injetor esteja pronto para coleta de dados.<ol>
<li>Se os cristais são cultivados em LCP, então sele-os e deixe-os permanecer em seringas por até alguns dias à temperatura ambiente.</li>
			<li>Se os cristais foram transferidos para uma mídia viscosa diferente (por exemplo, graxa de silicone), então um teste de estabilidade dos cristais ao longo do tempo deve ser realizado antes da medição. Isso determinará quanto tempo os cristais estão estáveis na mídia inerte (idealmente > 8 h) e o prazo para coleta de dados. Aqui, os cristais de lise foram estáveis por dias em graxa de silicone e não mostraram sinais de dissolução quando inspecionados usando um microscópio óptico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Mova toda a amostra para uma seringa antes de desconectar o acotravador. Desconecte o acotrador da seringa e conecte a agulha de injeção. Enrosque a agulha firmemente na base da seringa e certifique-se de que ela está bem presa para evitar vazamentos. Uma agulha de 108 μm (comprimento da agulha 13 mm, estilo ponto 3) foi usada para este experimento. Dependendo do tamanho do cristal e do tamanho do feixe, conecte uma agulha de 51 μm ou 108 μm. NOTA: O pré-teste do fluxo de amostras antes do tempo do feixe é necessário para poder selecionar o tamanho correto da agulha do injetor. Dependendo das características da amostra (ou seja, viscosidade, carregamento, composição tampão) e da ID da agulha, as amostras fluirão de forma diferente. Portanto, recomenda-se testar uma variedade de tamanhos de agulha para produzir o fluxo mais estável com a menor agulha de I.D. possível para maximizar a relação sinal-ruído durante a coleta de dados.</li>
	<li>Se o injetor já estiver montado e alinhado na linha do feixe, mova-se para a seção 3 e monte a seringa da amostra diretamente no injetor. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>2. Montagem e controle do injetor
<ol><li>Monte o injetor na linha de vigas. Remova o bocal criogênico na linha de feixe MX2 e substitua-o pelo injetor. Solte o parafuso de fixação que segura o bocal criogênico e fixe-o ao suporte localizado ao lado do estágio motorizado.</li>
	<li>Levante o injetor do carrinho segurando a alça preta e coloque-o no palco motorizado.<ol>
<li>Para fixar o injetor ao estágio motorizado; aperte a mão do botão do parafuso de fixação preto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte uma seringa vazia no injetor<ol>
<li>Na interface de controle do computador injetor (ou seja, software de controle de posição EPOS), selecione O Modo Homing em Ferramentas no menu de software. Em seguida, selecione O Interruptor de Limite Negativo e o Início do Homing,deixe o software funcionar até que o parafuso seja retraído o suficiente para que a seringa encaixe sob o parafuso. Se deixado para funcionar sem supervisão, o interruptor de limite pára automaticamente o parafuso.</li>
		<li>Monte uma seringa vazia ('manequim') no injetor inserindo a agulha através da fenda no suporte da seringa. Alinhe a seringa contra o suporte.</li>
		<li>Aperte a seringa com dois anéis O.<ol>
<li>Enrole o primeiro o-ring através da seção média da seringa anexando-o aos ganchos em ambos os lados da seringa.</li>
			<li>Enrole o segundo o-ring em torno dos ganchos na parte superior da seringa e, em seguida, coloque uma parte do anel O no topo da seringa de vidro, como mostrado na demonstração e figura 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alinhe o injetor ao raio-X<ol>
<li>Mova o estágio motorizado com o injetor em direção ao ponto de interação de raios-X através do software de controle de linha de vigas. Isso pode ser visualizado usando a câmera inline. O tamanho e a posição do feixe são denotados por uma cruz vermelha na tela e o estágio motorizado pode ser movido para alinhar a agulha com a região de interação raio-X.</li>
		<li>Ajuste a posição x e y do palco para alinhar a agulha com a cruz vermelha.</li>
		<li>Ajuste a posição z até que a ponta da agulha entre em foco.</li>
		<li>Verifique o alinhamento da ponta da agulha e do raio-X visualmente verificando se a ponta da seringa atende às miras que são visíveis na imagem do microscópio óptico gerada pela câmera de linha de luz.</li>
		<li>Uma vez que a ponta da agulha esteja alinhada, mova a ponta acima dos cabelos cruzados ~100 μm. Isso elimina a dispersão de raios-X da ponta da agulha. NOTA: A montagem e o alinhamento do injetor na linha de feixe MX2 no síncrotron devem ser realizados pelos cientistas da linha de trave e podem ser concluídos em menos de 30 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montagem da seringa amostral
<ol><li>Substitua a seringa vazia pela seringa amostrada seguindo o passo 2.3.</li>
	<li>Coloque a tampa injetora na cabeça do êmbolo da seringa da amostra.</li>
	<li>Mova o parafuso da unidade para a parte superior da tampa.</li>
	<li>No software de controle do injetor selecione Modo Velocidade.</li>
	<li>Entrada 3000 rpm (~115 nL/s) como o Valor de Configuração e pressione aplicar valor de configuração.</li>
	<li>Quando o parafuso da unidade tocar a tampa na cabeça do êmbolo da seringa, pare o motor.<ol>
<li>Defina o valor rpm a zero no software de controle do injetor alterando o Valor de Configuração para '0' à medida que o parafuso se aproxima da tampa.</li>
		<li>Uma vez feito o contato, ative o valor predefinido pressionando Aplicar valor de configuração para parar o parafuso instantaneamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mova suavemente a tampa para ter certeza de que ela está firmemente presa no lugar. NOTA: Sempre que um novo valor definido é inserido na caixa "Definir valor" no software de controle, ele só é ativado após pressionar o Apply Setting Value.</li>
</ol>4. Executando o injetor
<ol><li>Depois que o parafuso da unidade da tampa tiver feito contato firme com a parte superior do êmbolo, mude o valor de configuração rpm para 100. Isso equivale a ~ 4 nL/s.</li>
	<li>Inspecione visualmente a ponta da agulha quando a amostra sair pela primeira vez ou olhe a imagem da câmera de feixe da agulha para observar quando a amostra começa a extrusão da ponta da agulha.</li>
	<li>Faça uma busca na cabana, feche a porta da cabana e ligue o raio-X. A partir deste ponto, o injetor deve ser operado remotamente de fora da cabana.</li>
	<li>Sintonize o rpm até que um fluxo estável seja gerado.<ol>
<li>Diminua o valor de configuração rpm para 90.</li>
		<li>Repita o passo 4.4.1, diminuindo o valor de ajuste rpm em incrementos de 10, para diminuir a velocidade do fluxo, mas ainda manter um fluxo estável. Para graxa de silicone foi utilizado um valor de 30 rpm. NOTA: A faixa típica de rpm varia entre 30 a 100 rpm (1 – 4 nL/s) dependendo das características da amostra e do tempo de exposição ao raio-X. Em geral, a rpm deve ser ajustada para produzir a taxa de fluxo mais lenta (para minimizar o consumo de amostras) mantendo um fluxo estável.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerenciamento de um fluxo de amostra que não flui bem.<ol>
<li>Continue aumentando o valor de configuração rpm em incrementos de 10 até que o fluxo fique mais reto. Se o fluxo não estabilizar, mesmo depois de aumentar o valor de ajuste rpm para o valor máximo de 100 rpm tente melhorar a estabilidade implementando um dos dois métodos descritos abaixo.<ol>
<li>Primeiro método: Insira um apanhador de amostras de poliestireno sob o fluxo de amostras para ajudar a guiar a amostra. Este método funciona bem para fluxos de amostras altamente carregados.</li>
			<li>Segundo método: Insira um funil de sucção venturi no apanhador de amostras. Para fornecer ar ao funil, conecte-o ao tubo de saída de ar localizado na cabana. Este método pode auxiliar na direção e estabilização do fluxo amostral independente da carga do fluxo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez alcançado um fluxo constante e constante, inicie a coleta de dados e otimize a distância do detector de acordo com um experimento normal de cristalografia de raios-X. NOTA: A rpm é convertida em taxa de fluxo usando a tabela de conversão fornecida na Information Complementar, 'Lipidico Device Calculator'. Digite o valor de rpm, diâmetros da agulha e volumes de seringa para calcular a taxa de fluxo usando esta calculadora.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boutet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+protein+structure+determination+by+serial+femtosecond+crystallography.">High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography.</a> Science. 337 (6092), 362-364 (2012).</li><li>Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+delivery+using+viscous+media,+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography.">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li><li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure.">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li><li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography.">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li><li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography.">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345 (2016).</li><li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography.">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography.">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484 (2016).</li><li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase.">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li><li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography.">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).</li><li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography.">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li><li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography.">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li><li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science:+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art.">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li></ol>

MK trabalha para projetos Kusel. Kusel Design, um desenvolvedor de dispositivos de laboratório personalizado, foi contratado pelo Dr. Peter Bentsen da Universidade de La Trobe e pelo Dr. Tom Caradoc-Davies da ANSTO e para desenvolver um dispositivo de baixo custo para permitir estudos viscosos elevados na linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano. O dispositivo foi desenvolvido em estreita consulta com o Dr. Caradoc-Davies. Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Um HVI alternativo foi desenvolvido, ideal para a realização de experimentos SX em fontes síncrotrons. Ele tem duas vantagens fundamentais sobre os HVIs existentes. Primeiro, é fácil instalar na linha de trave permitindo uma comutação rápida entre cristalografia convencional e SX, apenas ~30 minutos é necessário para instalação e alinhamento no MX2. Em segundo lugar, as seringas amostrais usadas para cultivar cristais podem ser usadas diretamente como reservatórios para injeção, limitando o desperdício du...

A cristalografia serial (SX) é uma técnica que foi desenvolvida inicialmente no contexto de Lasers eletrônicos livres de raios-X (XFELs)1,2,3,4. Embora abordagens de alvo fixas possam ser usadas para SX5,6,7, normalmente, sistemas injetores são empregados para fornecer cristais em um fluxo contínuo para o feixe de raios-X. Por combinar dados de um grande número de cristais, o SX evita a necessidade de qualquer alinhamento de cristal durante o experimento, e permite que os dados sejam coletados à temperatura ambiente8,9. Com o auxílio de um injetor adequado, os cristais são transmitidos um a um na área de interação com raios-X e os dados de difração resultantes são coletados em um detector de área9,10. Até o momento, a SX foi bem sucedida na resolução de uma série de estruturas proteicas1,11,12,13 incluindocristais muito pequenos para medir usando a cristalografia convencional. Ele também forneceu novas percepções sobre a dinâmica molecular resolvida pelo tempo explorando a duração do pulso femtosegundo do XFEL. Iniciando reações de bomba-sonda com fontes ópticas de laser, estudos aprofundados foram realizados no fotossistema II14,15, proteína amarela fotoativa16,17, citocromo C oxidase18, bem como bacteriorhodopsin19,20,21. Esses estudos sondaram a dinâmica de transferência de elétrons que ocorrem após a ativação da luz demonstrando o potencial significativo da cristalografia serial para a compreensão de processos biológicos resolvidos pelo tempo.
O desenvolvimento da cristalografia serial também está se tornando cada vez mais prevalente nas fontes síncrotrons9,12,20,22,23,24. O SX baseado em síncrotron permite que um grande número de cristais individuais seja medido eficientemente à temperatura ambiente usando um sistema injetor apropriado. Essa abordagem é adequada para cristais menores, portanto, além de exigir um detector rápido de taxa de quadros para coletar os dados, um feixe micro-focado também é necessário. Em comparação com a cristalografia convencional, o SX não envolve a montagem e alinhamento de cristais individuais no feixe de raios-X. Como os dados de um grande número de cristais individuais são mesclados, a dose de radiação recebida por cada cristal pode ser substancialmente reduzida em comparação com a cristalografia convencional. O SX síncrotron também pode ser aplicado ao estudo de reações resolvidas pelo tempo, mesmo até o regime de milissegundos, desde que um detector com uma taxa de quadro suficientemente alta esteja disponível (por exemplo, 100 Hz ou mais). Vários experimentos de cristalografia serial foram realizados no síncrotron usando injetores que foram inicialmente desenvolvidos nas fontes XFEL20,22,23. Os dois tipos mais comuns de injetor são o Bocal Virtual Gas Dynamic (GDVN)25 e o Injetor Viscoso Alto (HVI)9,24,26,27,28. O GDVN é ideal para injetar baixa viscosidade, amostras líquidas, mas requer altas taxas de fluxo para alcançar fluxos estáveis, o que por sua vez leva a altas taxas de consumo amostral. Em contrapartida, os HVI's são adequados para amostras de alta viscosidade que permitem a geração de um fluxo estável a taxas de fluxo muito mais baixas, levando a um consumo amostral muito menor. O injetor HVI, portanto, favorece a entrega de amostras onde um portador viscoso é preferível (por exemplo, à base de lipídios para proteínas de membrana) e/ou grandes quantidades de amostra não estão disponíveis. Os injetores SX são geralmente desafiadores de usar e requerem treinamento extensivo para operar. Eles também envolvem protocolos longos de transferência de amostras, uma vez que a amostra precisa ser carregada em um reservatório especializado, isso geralmente tem um alto risco associado a ela de a amostra ser perdida no 'volume morto' ou através de vazamentos nas conexões. Portanto, é desejável otimizar o design do injetor para mitigar quaisquer perdas antes da amostra atingir o feixe de raios-X.
Recentemente, os primeiros resultados do SX foram publicados usando Lipidico23 com um alvo lysozyme, usando um detector Eiger 16M. Este projeto do injetor limita o desperdício da amostra, minimizando o número de etapas envolvidas na ida da cristalização inicial à transferência de cristais no injetor seguido pela entrega da amostra para o feixe de raios-X. Este manuscrito descreve e demonstra o procedimento de transferência de amostras a partir da preparação da amostra, passando para o processo de injeção e, finalmente, coleta de dados, usando o mesmo vaso de cristalização. O funcionamento do injetor também é descrito.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hen eggwhite lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicon grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector needle (108 &#181;m ID)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part No: 7803-05</td>
			<td>www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas-tight syringes, 100 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part no: 7656-01</td>
			<td>Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCP syringe coupler</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>209526</td>
			<td>Syringe coupler to mix the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidico injector</td>
			<td>La Trobe Univerity/ANSTO</td>
			<td></td>
			<td>This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron

Uma instalação para a realização de medições de cristalografia serial foi desenvolvida no síncrotron australiano. Esta instalação incorpora um injetor viscoso de alto efeito construído, Lipidico, como parte da linha de cristalografia macromolecular (MX2) para medir um grande número de pequenos cristais à temperatura ambiente. O objetivo desta técnica é permitir que cristais sejam cultivados/transferidos para seringas de vidro para serem usados diretamente no injetor para coleta de dados de cristalografia serial. As vantagens deste injetor incluem a capacidade de responder rapidamente às mudanças na taxa de fluxo sem interrupção do fluxo. Existem várias limitações para este injetor de alta viscosidade (HVI) que incluem uma restrição sobre as viscosidades amostrais permitidas para >10 Pa.s. A estabilidade do fluxo também pode ser um problema potencialmente dependendo das propriedades específicas da amostra. Um protocolo detalhado de como configurar amostras e operar o injetor para medições de cristalografia serial no síncrotron australiano é apresentado aqui. O método demonstra a preparação da amostra, incluindo a transferência de cristais de lise em uma alta mídia viscosa (graxa de silicone), e o funcionamento do injetor para coleta de dados em MX2.

Lipidico é um HVI construído como um sistema de entrega alternativa para uso em MX2 (Figura 1). É ideal para SX onde os cristais são cultivados em fase cúbica lipídica ou transferidos para uma alta mídia inerte viscosa.
Para demonstrar a aplicação injetora, a graxa de silicone misturada com cristais de lisezímola foi usada para coletar dados SX na linha de feixe MX2 no síncrotron australiano. Para montar o injetor na linha de feixe MX2, o bocal criogên...

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Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

O objetivo deste protocolo é demonstrar como preparar amostras de cristalografia serial para coleta de dados em um injetor viscoso alto, Lipidico, recentemente encomendado no síncrotron australiano.

Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.2K visualizações.  La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086. O objetivo deste protocolo é demonstrar como preparar amostras de cristalografia serial para coleta de dados em um injetor viscoso alto, Lipidico, recentemente encomendado no síncrotron australiano.

Vídeo: Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bioengenharia

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Síntese de hidrogeles com propriedades anti-deposição como membranas de purificação de água

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Entrada de poder de medições em biorreatores mexidas em escala de laboratório

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Injeção de Retroductal de nanopartículas para a glândula Submandibular murino

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

Sistema centrífuga de contrafluxo automatizado para processamento de células em pequena escala

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized matrix. This organization is challenging to replicate due to the heterogeneous environment of bone. Ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions (COBICS) is a microgel-based bioprinting technique that uniquely replicates the mineral and cellular structure of bone. COBICS prints complex, biologically relevant constructs without the need for sacrificial support materials or harsh postprocessing steps (e.g., radiation and high-temperature sintering), which are two of the biggest challenges in the additive manufacturing of bone mimetic constructs. This technique is enabled via the freeform extrusion of a novel calcium phosphate-based ink within a gelatin-based microgel suspension. The yield-stress properties of the suspension allow deposition and support the printed bone structure. UV crosslinking and nanoprecipitation then "lock" it in place. The ability to print nanostructured bone-mimetic ceramics within cell-laden biomaterials provides spatiotemporal control over macro- and micro-architecture and facilitates the real-time fabrication of complex bone constructs in clinical settings.

This protocol describes a 3D printing technique to fabricate bone-like structures by depositing a calcium phosphate ink in a gelatin-based granular support. Printed bone analogs are deposited in freeform, with flexibility for direct harvesting of the print or crosslinking within a living cell matrix for multiphasic constructs.

Bioimpressão Cerâmica Omnidirecional em Suspensões Carregadas de Células para a Geração de Análogos Ósseos

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a chemotherapeutic might be functionalized with an antibody to enhance binding to cancer cells (&#34;targeting&#34;) or functionalized with polyethylene glycol to help evade immune cell recognition (&#34;stealth&#34;). Even at a cellular level, optimizing the binding and uptake of a drug carrier is a complex biological design problem. Thus, it is valuable to separate how strongly a new carrier interacts with a cell from the functional efficacy of a carrier&#39;s cargo once delivered to that cell.
To continue the chemotherapeutic example, &#34;how well it binds to a cancer cell&#34; is a separate problem from &#34;how well it kills a cancer cell&#34;. Quantitative in vitro assays for the latter are well established and usually rely on measuring viability. However, most published research on cell-carrier interactions is qualitative or semiquantitative. Generally, these measurements rely on fluorescent labeling of the carrier and, consequently, report interactions with cells in relative or arbitrary units. However, this work can be standardized and be made absolutely quantitative with a small number of characterization experiments. Such absolute quantification is valuable, as it facilitates rational, inter- and intra-class comparisons of various drug delivery systems-nanoparticles, microparticles, viruses, antibody-drug conjugates, engineered therapeutic cells, or extracellular vesicles.
Furthermore, quantification is a prerequisite for subsequent meta-analyses or in silico modeling approaches. In this article, video guides, as well as a decision tree for how to achieve in vitro quantification for carrier drug delivery systems, are presented, which take into account differences in carrier size and labeling modality. Additionally, further considerations for the quantitative assessment of advanced drug delivery systems are discussed. This is intended to serve as a valuable resource to improve rational evaluation and design for the next generation of medicine.

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A workflow is demonstrated for the absolute quantification of drug carrier-cell interactions using flow cytometry to allow better rational evaluation of novel drug delivery systems. This workflow is applicable to drug carriers of any type.

Quantificação Experimental de Interações entre Sistemas de Liberação de Medicamentos e Células In Vitro: Um Guia para Avaliação Pré-Clínica de Nanomedicina

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Um novo método de injeção lenta minimamente invasivo para reduzir a lesão tecidual

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

Autor em destaque: um novo método de injeção de células com invasão mínima  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Um novo método de injeção de células com invasão mínima

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...