ברצוננו להודות לד"ר ג'וליה פיין על רעיונותיה ודיון בה במהלך תהליך יצירת הפרוטוקול, כמו גם לד"ר קסנדרה ורנייה על הערותיה המועילות במהלך העריכה. חומרים אלה תרמו לפרויקטים שנתמכו בחלקם על ידי הקרן לחקר המזון והחקלאות, תחת מענק ID 549025.

למחברים אין מה לחשוף.

כאן תיארנו שיטות המפרטות כל שלב בתהליך ההגברה והכנת מלאי האינוקולום של הנגיף, כולל איסוף זחלים והתפשטות הנגיף, מיצוי וריכוז הנגיף, כמו גם טיפול נגיפי בצורה של ניסויי האכלה בכלובים. שיטות אלה מאפשרות ייצור של חלקיקי נגיף טהורים למחצה (איור 4), שיעילותם ניתנת לכימות באופן עקב?...

דבורי הדבש (Apis mellifera) ממלאות תפקיד קריטי בנוף החקלאי העולמי המודרני, אך כיום הן סובלות משילוב של גורמי עקה ביוטיים וא-ביוטיים, כולל חשיפה לחומרי הדברה, מספוא לקוי, טפילים ופתוגנים 1,2. אחד הפתוגנים החשובים ביותר לדאגה הם וירוסים, שרבים מהם מווסתים על ידי עוד אחד מגורמי העקה העיקריים של דבורת הדבש, קרדית Varroa הטפילית (Varroa destructor). נגיפים אלה יכולים לגרום למגוון של השפעות שליליות בדבורי הדבש, כולל ירידה בהישרדות גזעית, פגמים התפתחותיים ושיתוק שיכולים להוביל לקריסת כוורת מוחלטת הן לפני תקופות החורף והן לאחריהן 3,4,5. למרות שחלה התקדמות מבטיחה בפיתוח טכנולוגיות המשמשות למאבק בהדבקה בנגיף 6,7,8,9, הדינמיקה שבה וירוסים רבים מתפשטים, מתפשטים ומתקשרים בתוך דבורת דבש או מושבה עדיין לא מובנת היטב 5,10 . הבנת הביולוגיה הבסיסית של אינטראקציות בין דבורי דבש ונגיפים והקשרים שלהן עם גורמים סביבתיים אחרים היא קריטית לפיתוח טכניקות יעילות לניהול וירוסים.
עם זאת, חקר האינטראקציות בין דבורי הדבש לנגיף מציב אתגרים עם גורמים ידועים ובלתי ידועים רבים המסבכים את התהליך. אלה כוללים אינטראקציות עם תזונה11,12, חשיפה לחומרי הדברה13 ורקע גנטי לדבורים14,15. גם כאשר מתמקדים בהדבקה בנגיף בלבד, סיבוכים נפוצים משום שלאוכלוסיות דבורי הדבש, המנוהלות והפראיות כאחד, יש תמיד מידה מסוימת של זיהום בנגיף הרקע, אם כי לעתים קרובות מבלי לבטא תסמינים חריפים 16,17, וההשפעות של הדבקה בנגיף אינן מובנות היטב18. זה הפך את המחקר של השפעות וירוס דבורת הדבש קשה להתנתק.
מחקרים רבים על נגיף דבורי הדבש השתמשו בזיהומים נסיבתיים של הנגיף כדי לחפש אינטראקציות עם גורמי עקה אחרים, וראו כיצד זיהומי הרקע משתנים עם טיפולים אחרים 12,19,20,21. בעוד שגישה זו הצליחה לזהות השפעות חשובות, במיוחד לגלות כיצד חומרי הדברה או טיפולים תזונתיים משפיעים על רמות הנגיף ועל שכפולם, חיסון באמצעות טיפול בנגיף של תוכן וריכוז ידועים הוא קריטי לבדיקה ניסיונית של דינמיקת זיהום בנגיף. עם זאת, הפרדת הטיפול הניסיוני מזיהום הרקע עלולה גם היא להציב אתגרים. במחקרי שדה, חוקרים הבחינו בין זנים של נגיף כנף מעוות (DWV) כדי לספק ראיות להעברת הנגיף מדבורי דבש לדבורי בומבוס22, אך שימוש בגישה זו יהיה קשה בקרב דבורי הדבש בלבד. שיבוטים זיהומיים של וירוסים הם כלי רב עוצמה, לא רק למעקב אחר זיהום 23,24,25 אלא למחקרי גנטיקה הפוכה של נגיפי דבורי דבש ולמחקר אינטראקציה בין וירוסים למארח 26,27,28. עם זאת, ברוב המקרים, שיבוטים זיהומיים עדיין נדרשים כדי למלא את מחזור ההדבקה בתוך התאים כדי לייצר חלקיקים. חלקיקים כאלה מועדפים כאנוקולה לטיפולים ניסיוניים מכיוון שהזיהום שלהם גבוה יותר מהרנ"א הנגיפי העירום והחיסון בגנומים עטוף מחקה זיהום טבעי.
גם הייצור של אינוקולה של נגיף דבורת הדבש הטהור והלא מזוהם (זני וירוסים מסוג בר או כאלה שמקורם בשיבוטים זיהומיים) מציב אתגרים. אלה נובעים בעיקר מהקשיים בהשגת קו אמין, המשכפל ברציפות, של תאי דבורת דבש נטולי וירוסים, כדי לייצר נגיפים בעלי זן טהור29,30. בעוד שכמה קווי תאים יוצרו, מערכות אלה נותרו לא מושלמות; ובכל זאת, יש תקווה שניתן יהיה לייצר קו תאים בר קיימא29, שיאפשר שליטה עדינה יותר על ייצור וירוסים וחקירה. עד שקו כזה יהיה זמין באופן נרחב, רוב פרוטוקולי ייצור הנגיף ימשיכו להסתמך על שימוש בייצור וטיהור של וירוסים in vivo 18,31,32,33,34. גישות אלה כוללות זיהוי וטיהור של חלקיקי נגיף בעלי עניין (או ייצור שיבוט מדבק) ושימוש בהם כדי להדביק דבורי דבש, בדרך כלל כגלמים. הגלמים מוזרקים עם נגיף המטרה ולאחר מכן מוקרבים, וחלקיקים נוספים מופקים ומטוהרים. עם זאת, מכיוון שדבורים אינן נקיות מווירוסים מלכתחילה, תמיד יש מידה מסוימת של זיהום מעקבות של וירוסים אחרים בכל תרכיז כזה, ולכן יש לנקוט בזהירות רבה בבחירת דבורים עם סבירות נמוכה לזיהומי רקע. יתר על כן, שיטות להסרת הגלמים מתאי המסרק לשימוש בפרוטוקולים אלה33 הן עתירות עבודה מאוד ויכולות לגרום ללחץ אצל הדבורים, ולהגביל את הייצור באמצעים אלה18,32. כאן אנו מדווחים על שיטה חלופית המאפשרת הסרה בקנה מידה גדול של זחלים עם מעט עבודה ופחות לחץ מכני על הדבורים.
לאחר שהגלמים מתקבלים ומוזרקים להם אינוקולום הנגיף ההתחלתי, יש לדוגר אותם כדי לספק לנגיף זמן להשתכפל. לאחר מכן, ניתן לעבד חלקיקי נגיף המיוצרים לצורה שמישה כדי להדביק דבורים ניסיוניות. ישנן מספר שיטות פשוטות להשיג זאת, כולל שימוש בהומוגנט גולמי35,36 או המולימפה שנוצר מדבורים נגועות בנגיף כמקור לזיהום37. שיטות אלה יעילות, אך יש להן סיכוי גדול יותר להכניס משתנים לא ידועים ממצע הרקע (למשל, גורמים אחרים בהומוגנטים של הדבורים המתות). בנוסף, רצוי לרכז את החלקיקים אם ניסוי דורש מתן מינון גדול וידוע של וירוס בפרק זמן קצר. לכן, לשליטה טובה יותר, עדיף להשתמש בשיטות המאפשרות רמה מסוימת של טיהור וריכוז של חלקיקי הנגיף. באופן כללי, סדרה של צעדי משקעים וצנטריפוגה תביא להסרת כמעט כל החומר האפשרי שאינו קשור לנגיף33.
לאחר הפקת אינוקולום מרוכז זה, כדאי לכמת את הטיטרים הנגיפיים (qPCR) ולאפיין אותו עם bioassays in vivo כדי לבחון את הכדאיות שלו ואת יכולתו לגרום לתמותה, כמו גם כדי לאשש כי titers וירוס מוגבר מתקבלים לאחר ההדבקה. ניתן להשיג זאת באמצעות ניסויי הזרקה (לתוך גלמים או מבוגרים) או ניסויי האכלה (לזחלים או למבוגרים). בעוד שכל הגישות הללו אפשריות, האכלה לקבוצות של דבורים בוגרות בכלוב היא לעתים קרובות המהירה והפשוטה ביותר. שיטת בדיקת הכלובים נמצאת בשימוש נרחב גם לבדיקת טיפולים שונים אחרים בדבורים, כולל רעילות חומרי הדברה38, התפתחות שחלה39 והשפעה תזונתית על התנהגות40,41, ולכן יכולה להוות בסיס טוב לניסויים הקושרים בין זיהום בנגיף לגורמים אחרים42.
כאן אנו מתארים שיטה אמינה לייצור כמויות גדולות של חלקיקי נגיף טהורים למחצה, מועשרים מאוד, ללא שימוש ב-ultracentrifuge יקר, כולל שיטה להסרת גלמים המפחיתה את הלחץ הנגרם והלחץ המכני על הדבורים ובדיקה ביולוגית בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה לבדיקת זיהום והשפעות נגיפיות. על ידי שליטה הדוקה בטוהר האינוקולה הנגיפית, החוקרים מסוגלים להפחית את השונות בתגובה הנגיפית של דבורת הדבש ביחס לשיטות חיסון ויראליות אחרות. יתר על כן, הבדיקה הביולוגית יכולה לסנן השפעות ויראליות ברמת קבוצות קטנות באמצעות יחידות ניסיוניות הניתנות לחזרה רבה לפני שינוי קנה המידה להגדרות מציאותיות בשטח, וזה הרבה יותר עבודה אינטנסיבית לניהול. בשילוב, שתי השיטות הללו מספקות את הכלים הדרושים למחקרים שיכולים לעזור לשפר את ההבנה הכוללת שלנו של אינטראקציות פיזיולוגיות בין דבורי דבש לנגיף.

<table><tbody><tr><td>10% bleach solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cages for bioassay</td><td></td><td></td><td>Dependent on experimental setup</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0.1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>Containers for larval self-removal</td><td></td><td></td><td>Should measure roughly 19&quot; x 9-1/8&quot; (Langstroth deep frame dimensions)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Capable of maintaining 34 &amp;ordm;C and 50% relative humidity</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Any absorbent wipe will work</td></tr><tr><td>Medium-sized weight boats</td><td></td><td></td><td>Serve as inoculum trays</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 15,000 x g</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 21,000 x g</td></tr><tr><td>Repeater M4 Multipipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free water</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

לדבורי הדבש יש חשיבות אקולוגית וחקלאית רבה ברחבי העולם, אך הן גם נתונות למגוון לחצים המשפיעים לרעה על בריאות הדבורים, כולל חשיפה לפתוגנים נגיפיים. וירוסים כאלה יכולים לגרום למגוון רחב של השפעות הרסניות ולעתים קרובות יכולים להיות מאתגרים למחקר בשל גורמים רבים המקשים על הפרדת ההשפעות של טיפולים ניסיוניים מזיהום רקע קיים מראש. כאן אנו מציגים שיטה לייצור המוני של כמויות גדולות של חלקיקי וירוסים יחד עם בדיקה ביולוגית בתפוקה גבוהה לבדיקת זיהום והשפעות נגיפיות. כתוצאה מהיעדר הנוכחי של קו תאי דבורת דבש רציפים ונטולי וירוסים, חלקיקים נגיפיים מוגברים in vivo באמצעות גולמי דבורת דבש, המופקים מהכוורת בכמויות גדולות באמצעות מתודולוגיה מלחיצה מינימלית. לאחר מכן ניתן להשתמש בחלקיקי הנגיף האלה בבדיקות ביולוגיות של כלובי דבורי דבש כדי לבחון את כדאיות האינוקולה, כמו גם בדינמיקות שונות אחרות של זיהום בנגיף, כולל אינטראקציות עם תזונה, חומרי הדברה ופתוגנים אחרים. יתרון מרכזי של שימוש בחלקיקים כאלה הוא שהוא מקטין מאוד את הסיכויים להחדרת משתנים לא ידועים בניסויים הבאים בהשוואה לחלופות הנוכחיות, כגון זיהום באמצעות המולימפה של דבורים נגועות או הומוגנט, אם כי עדיין יש לנקוט משנה זהירות בעת מיקור הדבורים, כדי למזער את זיהום נגיף הרקע. מבחני הכלובים אינם תחליף לניסויים רחבי היקף ומציאותיים בשטח הבודקים את השפעות ההדבקה בנגיף ברמת המושבה, אלא מתפקדים כשיטה ליצירת תגובות נגיפיות בסיסיות, שבשילוב עם חלקיקי הנגיף הטהורים למחצה, יכולות לשמש ככלים חשובים לבחינת ממדים שונים של אינטראקציות פיזיולוגיות בין דבורי דבש לנגיף.

מעקב מוצלח אחר הפרוטוקולים (איורים 1) להזרקת pupal ומיצוי נגיפי אמור לייצר כמויות גדולות של חלקיקי וירוסים. עם זאת, דגימה והזרקה של גלמים שמקורם ממגוון מושבות בנקודות זמן מרובות ממקסמת את הסיכויים לרכוש וירוס מטרה עם זיהום נמוך. הדינמיקה שבאמצעותה וירוסים משכפלים ומתקשרים זה עם זה ב...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים: ראשית להפצה, חילוץ, טיהור וכימות כמויות גדולות של חלקיקי נגיף שאינם עטופים בדבורי דבש, כולל שיטה להסרת גלמי דבורת הדבש ושנית לבדיקת ההשפעות של זיהום נגיפי באמצעות בדיקה ביולוגית של כלובים בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה.

הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K Views.  University of Illinois. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים: ראשית להפצה, חילוץ, טיהור וכימות כמויות גדולות של חלקיקי נגיף שאינם עטופים בדבורי דבש, כולל שיטה להסרת גלמי דבורת הדבש ושנית לבדיקת ההשפעות של זיהום נגיפי באמצעות בדיקה ביולוגית של כלובים בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה.

Video: Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

פרמקולוגיה ההתנהגות של התניה קלאסית תגובת הרחבה חוטם ב דבורי דבש ( אפיס מליפרה)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Neuroscience

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Environment

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

הערכת ההשפעה של כימיקלים סביבתיים על התפתחות דבורת דבש מן הפרט אל רמת קולוני

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

מיזוג מישוש וניתוח תנועה של אסטרטגיות דגימת מחושים בדבורי דבש (<em&gt; תפיס mellifera</em&gt; ל &#39;)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג&#39;ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (<em&gt; אפיס mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

רביה של<em&gt; וירוס-01 coagulata Homalodisca</em&gt; דרך<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; תרבות תא

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Immunology and Infection

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

הכנת מושבות אחת-עוקבה טיפול הורמונלי של דבורי הדבש Worker לנתח Associated פיזיולוגיה עם תפקיד ו / או המערכת האנדוקרינית

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

מניפולציה Neuropharmacological של מאופקים חינם-עף דבש דבורים,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of gene function. We use this method in this study to check for the specificity of antibodies developed against the insect GABAA receptor subunit Resistance to Dieldrin (RDL) and a metabotropic glutamate receptor mGlutR1 (mGluRA). The antibodies were generated in rabbits against the conjugated peptides specific to fruit flies (Drosophila melanogaster) as well to honeybees (Apis mellifera). We used these antibodies in honeybee brain sections to study the distribution of the receptors in honeybee brains. The antibodies were affinity purified against the peptide and tested with immunoblotting and the classical method of preadsorption with peptide conjugates to show that the antibodies are specific to the corresponding peptide conjugates against which they were raised. Here we developed the CRISPR-Cas9 technique to test for the reduction of protein targets in the brain 48 h after CRISPR-Cas9 injection with guide RNAs designed for the corresponding receptor. The CRISPR-Cas9 method can also be used in behavioral analyses in the adult bees when one or multiple genes need to be modified.

Presented here is a protocol to use the CRISPR-Cas9 system for reducing the production of a protein in the adult honeybee brain to test antibody specificity.

Anti-RDL ו Anti-mGlutR1 קולטנים נוגדן בדיקות בסעיפים המוח הונאיבי באמצעות CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרמקולוגיה ההתנהגות של התניה קלאסית תגובת הרחבה חוטם ב דבורי דבש ( אפיס מליפרה)

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

הערכת ההשפעה של כימיקלים סביבתיים על התפתחות דבורת דבש מן הפרט אל רמת קולוני

מיזוג מישוש וניתוח תנועה של אסטרטגיות דגימת מחושים בדבורי דבש (

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג'ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (

רביה של

הכנת מושבות אחת-עוקבה טיפול הורמונלי של דבורי הדבש Worker לנתח Associated פיזיולוגיה עם תפקיד ו / או המערכת האנדוקרינית

מניפולציה Neuropharmacological של מאופקים חינם-עף דבש דבורים,

Anti-RDL ו Anti-mGlutR1 קולטנים נוגדן בדיקות בסעיפים המוח הונאיבי באמצעות CRISPR-Cas9

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה