פרוטוקול זה משתמש בשיטה הניתנת למיחזור ולשינוי בייצור תרכובות ספירוציקליות. מבחן MTT עוזר לענות על השאלה הנוגעת לציטוטוקסיות של מולקולות חדשות אלה. טכניקה זו מייצרת מולקולות חדשות הניתנות לשינוי באמצעות חומר מוצא מתחדש.
בדיקת MTT מספקת תוצאות ביולוגיות מהירות יחסית, וקלות לניתוח בגין על ידי ביצוע סינתזת פאזה מוצקה של מחזורי הטרו ספירוציקליים שש ושבע, כפי שהוכח בעבר. הכן 20 מיליליטר של תמיסת MTT של חמישה מיליגרם למיליליטר באמצעות PBS סטרילי כדילול. סנן ואחסן את התמיסה במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הכן דילול אחד על אחד של תמיסת MTT ב- DMEM. הכן מיליליטר אחד כל אחד מפתרונות המלאי בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר של תרכובות בדיקה ב- DMSO. אחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס.
הכן 200 מיקרוליטר למנה של פתרונות עבודה של תרכובות בדיקה על ידי דילול ריכוזי המלאי. 1 עד 1000 בסרום ללא מדיום. בזרעי תרבית הרקמה, COS שבעה תאים במדיום שלם על תרבית רקמה תחתית שטוחה טיפלו ב-96 צלחות באר בריכוז של 4, 000 תאים לכל 200 מיקרוליטר לבאר.
באמצעות פייפטר רב ערוצי. לדגור על התאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% פחמן דו חמצני. למחרת, שאפו את הסופרנאטנט מהבארות באמצעות פיפטה מרעה מזכוכית המחוברת למשאבת ואקום.
מינון התאים משולש עם תרכובות הבדיקה באמצעות פתרונות עבודה שהוכנו בעבר. לאחר מכן להחזיר את התאים לאינקובטור. לאחר 24 שעות, שאפו את הסופרנאטנט מהבארות והוסיפו 200 מיקרוליטרים של תמיסת MTT לכל באר.
לדגור את הצלחת במשך ארבע שעות. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט מהבארות מבלי להפריע לגבישי הפורמזאן הסגולים. הוסף 200 מיקרוליטרים של DMSO לכל באר כדי להמיס את הגבישים.
לאחר מכן לדגור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. מדוד את הספיגה עבור כל באר ב 590 או 600 ננומטר באמצעות קורא לוחות באר 96. השתמש בארות ללא תאים כרקע וממוצע ערך הספיגה.
תפרי גוקס ספירוציקליים שישה ושבעה סונתזו באמצעות פרוטוקול שונה. התקדמות התגובה הייתה במעקב על ידי גילוי היעלמותה של אסתר הבלתי רוויה אלפא בטא באמצעות ספקטרוסקופיית אינפרא אדום. בדיקת MTT שימשה לקביעת כדאיות התא.
ציספלטין, הידוע כגורם למוות תאי בריכוזים גבוהים, שימש כבקרה חיובית. כצפוי, ככל שריכוז הציספלטין גבוה יותר כך כדאיות התא נמוכה יותר. לאחר מכן נעשה שימוש בבדיקת ה-MTT כדי לבחון את התרכובות הספירוציקליות שש ושבע ופורפורילאמין.
פורפורילאמין ותפר גוקס ספירוציקלי 6 הראו ציטוטוקסיות דומה. עם זאת, הרעילות של תרכובת ספירוציקלית שבע הייתה גדולה במידה ניכרת מזו של פורפורילאמין ושישה. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי N-alkylation שבוצעה באמצעות אציל halides מגושם נמצא להפחית את קצב חיסול בטא ובכך להפחית את תפוקת המוצר.
