Dieses Protokoll verwendet eine recycelbare und modifizierte Methode zur Herstellung spirocyclischer Verbindungen. Der MTT-Assay hilft, die Frage nach der Zytotoxizität dieser neuartigen Moleküle zu beantworten. Diese Technik erzeugt neuartige modifizierbare Moleküle unter Verwendung eines regenerierenden Ausgangsmaterials.
Der MTT-Assay liefert relativ schnelle und einfach zu analysierende biologische Ergebnisse Beginnen Sie mit der Durchführung der Festphasensynthese der spirozyklischen Heterozyklen sechs und sieben, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie 20 Milliliter einer fünf Milligramm pro Milliliter MTT-Lösung mit sterilem PBS als Verdünnungsmittel vor. Filtern und lagern Sie die Lösung bei minus 20 Grad Celsius.
Anschließend wird eine Eins-zu-eins-Verdünnung der MTT-Lösung in DMEM hergestellt. Bereiten Sie je einen Milliliter Stammlösungen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Testverbindungen aus DMSO vor. Lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.
Bereiten Sie 200 Mikroliter pro Dosis der Arbeitslösungen von Testverbindungen durch Verdünnen der Stammkonzentrationen vor. Ein bis 1000 in serumfreiem Medium. In den Gewebekultursamen behandelten COS-sieben Zellen in vollständigem Medium auf flachem Boden Gewebekultur 96 Well-Platten mit einer Konzentration von 4.000 Zellen pro 200 Mikroliter pro Well.
Mit einem Mehrkanal-Pipeter. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthält. Am nächsten Tag saugen Sie den Überstand aus den Brunnen mit einer Glasweidepipette ab, die an einer Vakuumpumpe befestigt ist.
Dosieren Sie die Zellen dreifach mit den Testverbindungen unter Verwendung der zuvor hergestellten Arbeitslösungen. Dann bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück. Nach 24 Stunden saugen Sie den Überstand aus den Vertiefungen ab und fügen Sie jedem Bohrloch 200 Mikroliter MTT-Lösung hinzu.
Inkubieren Sie die Platte für vier Stunden. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen ab, ohne die violetten Formazankristalle zu stören. Fügen Sie 200 Mikroliter DMSO in jede Vertiefung hinzu, um die Kristalle aufzulösen.
Anschließend die Platte bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. Messen Sie die Absorption für jede Vertiefung bei 590 oder 600 Nanometern mit einem 96-Well-Plattenleser. Verwenden Sie Vertiefungen ohne Zellen als Hintergrund und mitteln Sie den Absorptionswert.
Die Spirozyklischen Gox-Nähte sechs und sieben wurden mit einem modifizierten Protokoll synthetisiert. Der Verlauf der Reaktion wurde überwacht, indem das Verschwinden der alpha-beta-ungesättigten Esther mittels Infrarotspektroskopie nachgewiesen wurde. Der MTT-Assay wurde zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit verwendet.
Cisplatin, von dem bekannt ist, dass es bei hohen Konzentrationen den Zelltod induziert, diente als Positivkontrolle. Wie erwartet, ist die Zelllebensfähigkeit umso geringer, je höher die Konzentration von Cisplatin ist. Der MTT-Assay wurde dann verwendet, um die spirocyclischen Verbindungen sechs und sieben und Furfurylamin zu testen.
Furfurylamin und spirozyklische Gox-Naht sechs zeigten eine ähnliche Zytotoxizität. Die Toxizität der spirocyclischen Verbindung sieben war jedoch deutlich größer als die von Furfurylamin und sechs. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die N-Alkylierung unter Verwendung sperriger Acylhalogenide die Beta-Eliminationsrate reduziert und somit die Produktausbeute verringert.
