このプロトコルは、スピロ環式化合物を製造する際にリサイクル可能で修正された方法を利用しています。MTTアッセイは、これらの新規分子の細胞毒性に関する質問に答えるのに役立ちます。この技術は、再生出発物質を用いて新規な修飾可能な分子を生成する。
MTTアッセイは、以前に実証したように、比較的迅速で、かつ容易に分析できる生物学的結果を提供するスピロ環式ヘテロサイクル6および7の固相合成を行うことから始める。希釈剤として滅菌PBSを使用して、20ミリリットルの5ミリグラム/ミリリットルのMTT溶液を調製します。溶液をろ過し、摂氏マイナス20度で保管します。
次に、DMEMでMTT溶液の1対1希釈液を調製する。DMSO中の試験化合物の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに各1ミリリットルのストック溶液を調製する。マイナス20°Cで保管してください。
ストック濃度を希釈することによって、試験化合物の作業溶液の用量あたり200マイクロリットルを調製する。無血清培地で1〜1000。組織培養種子において、平底組織培養上の完全培地中の7細胞を、1ウェルあたり200マイクロリットルあたり4,000細胞の濃度で処理した96ウェルプレート上にCOSした。
マルチチャンネルピペッターを使用する。5%二酸化炭素を含む雰囲気中で摂氏37度で24時間細胞をインキュベートします。翌日、真空ポンプに取り付けられたガラス製牧草ピペットを用いてウェルから上清を吸引する。
事前に調製した作業溶液を使用して、試験化合物を3回で細胞に投与します。その後、細胞をインキュベーターに戻します。24時間後、ウェルから上清を吸引し、各ウェルに200マイクロリットルのMTT溶液を加えます。
プレートを4時間インキュベートします。紫色のホルマザン結晶を乱すことなく、ウェルから上清を穏やかに吸引します。各ウェルに200マイクロリットルのDMSOを加えて結晶を溶解します。
次に、プレートを室温で15分間インキュベートします。96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を590または600ナノメートルで測定します。細胞を含まないウェルをバックグラウンドとして使用し、吸光度値を平均します。
スピロサイクリックゴックスシーム6および7は、修正されたプロトコルを用いて合成された。反応の進行は、赤外分光法を用いてアルファベータ不飽和エステルの消失を検出することによってモニターした。MTTアッセイは、細胞生存率を決定するために使用されました。
高濃度で細胞死を誘導することが知られているシスプラチンは、ポジティブコントロールとして機能しました。予想通り、シスプラチンの濃度が高いほど、細胞生存率は低くなります。次いで、MTTアッセイを用いて、スピロ環状化合物6および7ならびにフルフリルアミンを試験した。
フルフリルアミンおよびスピロサイクリックゴックスシームシックスは、同様の細胞毒性を示した。しかし、スピロ環状化合物7の毒性は、フルフリルアミンおよび6の毒性よりも著しく大きかった。このプロトコルを試みる場合、かさばるハロゲン化アシルを使用して実行されるN-アルキル化は、ベータ除去の速度を低下させ、したがって生成物収率を低下させることがわかったことに留意してください。
