Bu protokol, spirosiklik bileşiklerin üretiminde geri dönüştürülebilir ve modifiye edilmiş bir yöntem kullanır. MTT testi, bu yeni moleküllerin sitotoksisitesi ile ilgili soruyu cevaplamaya yardımcı olur. Bu teknik, yenileyici bir başlangıç malzemesi kullanarak yeni değiştirilebilir moleküller üretir.
MTT testi, biyolojik sonuçları analiz etmek için nispeten hızlı ve kolay sağlar Daha önce gösterildiği gibi, spirosiklik hetero döngülerin altı ve yedisinin katı faz sentezini gerçekleştirerek başlayın. Seyreltici olarak steril PBS kullanarak mililitre başına beş miligramlık bir MTT çözeltisinin 20 mililitresini hazırlayın. Çözeltiyi eksi 20 santigrat derecede filtreleyin ve saklayın.
Ardından, DMEM'deki MTT çözeltisinin bire bir seyreltilmesini hazırlayın. DMSO'daki test bileşiklerinin 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde stok çözeltilerinin her biri bir mililitre hazırlayın. Onları eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Stok konsantrasyonlarını seyrelterek test bileşiklerinin çalışma çözeltilerinin dozu başına 200 mikrolitre hazırlayın. Serum içermeyen ortamda bir ila 1000. Doku kültürü tohumlarında, COS yedi hücresi, düz taban doku kültürü üzerine tam bir ortamda, kuyu başına 200 mikrolitre başına 4.000 hücre konsantrasyonunda 96 kuyu plakasını işlemden geçirdi.
Çok kanallı pipet kullanma. Hücreleri% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bir vakum pompasına bağlı bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı kuyulardan aspire edin.
Daha önce hazırlanmış çalışma çözeltilerini kullanarak hücreleri test bileşikleri ile üçlü olarak dozlayın. Ardından hücreleri inkübatöre geri döndürün. 24 saat sonra, süpernatantı kuyulardan aspire edin ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre MTT çözeltisi ekleyin.
Plakayı dört saat boyunca inkübe edin. Mor formazan kristallerini rahatsız etmeden süpernatantı kuyucuklardan nazikçe aspire edin. Kristalleri çözmek için her bir oyuğa 200 mikrolitre DMSO ekleyin.
Daha sonra plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 96 kuyu plakası okuyucu kullanarak her kuyu için emiciliği 590 veya 600 nanometrede ölçün. Arka plan olarak hücresiz kuyular kullanın ve absorbans değerinin ortalamasını alın.
Spirosiklik gox dikişleri altı ve yedi, modifiye edilmiş bir protokol kullanılarak sentezlendi. Reaksiyonun ilerlemesi, kızılötesi spektroskopi kullanılarak alfa beta doymamış Ester'in kaybolması tespit edilerek izlendi. MTT testi, hücre canlılığını belirlemek için kullanıldı.
Yüksek konsantrasyonlarda hücre ölümünü indüklediği bilinen Cisplatin, pozitif bir kontrol görevi gördü. Beklendiği gibi, sisplatin konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, hücre canlılığı o kadar düşüktür. MTT testi daha sonra spirosiklik bileşikler altı ve yedi ve furfurilamin'i test etmek için kullanıldı.
Furfurilamin ve spirosiklik gox dikiş altı benzer sitotoksisite gösterdi. Bununla birlikte, spirosiklik bileşik yedi'nin toksisitesi, furfurilamin ve altıdan belirgin şekilde daha büyüktü. Bu protokolü denerken, hacimli açil halojenürler kullanılarak gerçekleştirilen N-alkilasyonun, beta eliminasyon oranını azalttığı ve böylece ürün verimini düşürdüğü tespit edildi.
