이 프로토콜은 스피로 클릭 화합물을 생산할 때 재활용 가능하고 변형 된 방법을 사용합니다. MTT 분석은 이러한 새로운 분자의 세포 독성과 관련된 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술은 재생 출발 물질을 사용하여 새로운 변형 가능한 분자를 생산합니다.
MTT 분석은 이전에 입증된 바와 같이 스피로사이클릭 헤테로사이클 6 및 7의 고체상 합성을 수행하여 시작하는 비교적 빠르고 쉬운 생물학적 결과를 제공합니다. 희석제로 멸균 PBS를 사용하여 밀리리터당 5밀리그램의 MTT 용액 20밀리리터를 준비합니다. 용액을 여과하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.
이어서, DMEM에서 MTT 용액의 일대일 희석액을 준비한다. DMSO에서 테스트 화합물의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 각각 1 밀리리터의 스톡 용액을 준비하십시오. 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.
스톡 농도를 희석하여 시험 화합물의 작업 용액 당 200 마이크로 리터를 준비하십시오. 혈청이없는 배지에서 1에서 1000까지. 조직 배양 종자에서, COS 7 세포를 평평한 바닥 조직 배양 위에 완전한 배지로 웰 당 200 마이크로리터당 4, 000 세포의 농도로 96 웰 플레이트를 처리하였다.
다중 채널 파이퍼 사용. 세포를 5%이산화탄소를 포함하는 분위기에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 진공 펌프에 부착 된 유리 목초지 피펫을 사용하여 우물에서 상청액을 흡인하십시오.
이전에 준비된 작업 용액을 사용하여 시험 화합물로 세포를 3 배로 투여하십시오. 그런 다음 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 24 시간 후, 웰에서 상청액을 흡입하고 각 웰에 200 마이크로 리터의 MTT 용액을 첨가한다.
플레이트를 4 시간 동안 배양하십시오. 보라색 포르 마잔 결정을 방해하지 않고 우물에서 상청액을 부드럽게 흡인하십시오. 결정을 용해시키기 위해 각 웰에 200 마이크로 리터의 DMSO를 첨가하십시오.
그런 다음 플레이트를 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 96웰 플레이트 리더를 사용하여 590 또는 600나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 세포가 없는 웰을 배경으로 사용하고 흡광도 값을 평균화합니다.
스피로사이클릭 곡스 이음새 6 및 7은 변형된 프로토콜을 사용하여 합성하였다. 반응의 진행은 적외선 분광법을 사용하여 알파 베타 불포화 에스더의 소멸을 검출함으로써 모니터링하였다. MTT 분석을 세포 생존율을 결정하기 위해 사용하였다.
고농도에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 시스플라틴은 양성 대조군으로 작용했습니다. 예상대로, 시스플라틴의 농도가 높을수록 세포 생존율이 낮아진다. 이어서, MTT 분석을 사용하여 스피로사이클릭 화합물 6 및 7과 푸르푸릴아민을 시험하였다.
푸르푸릴아민 및 스피로고사이클릭 심식스는 유사한 세포독성을 나타내었다. 그러나, 스피로 클릭 화합물 7의 독성은 푸르 푸릴 아민 및 6의 독성보다 눈에 띄게 컸다. 이 프로토콜을 시도할 때 부피가 큰 아실 할라이드를 사용하여 수행된 N-알킬화는 베타 제거 속도를 감소시켜 제품 수율을 감소시키는 것으로 나타났습니다.
