Questo protocollo utilizza un metodo riciclabile e modificato nella produzione di composti spirociclici. Il test MTT aiuta a rispondere alla domanda relativa alla citotossicità di queste nuove molecole. Questa tecnica produce nuove molecole modificabili utilizzando un materiale di partenza rigenerante.
Il test MTT fornisce risultati biologici relativamente rapidi e facili da analizzare Inizia eseguendo la sintesi in fase solida dei cicli etero spirociclici sei e sette, come precedentemente dimostrato. Preparare 20 millilitri di una soluzione MTT da cinque milligrammi per millilitro utilizzando PBS sterile come diluente. Filtrare e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius.
Quindi, preparare una diluizione uno-a-uno della soluzione MTT in DMEM. Preparare un millilitro ciascuna di soluzioni madre in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri di composti in esame in DMSO. Conservali a meno 20 gradi Celsius.
Preparare 200 microlitri per dose delle soluzioni di lavoro dei composti in esame diluendo le concentrazioni di stock. Uno a 1000 in mezzo libero da siero. Nei semi di coltura tissutale, COS sette cellule in mezzo completo su coltura tissutale a fondo piatto hanno trattato 96 piastre di pozzetto ad una concentrazione di 4.000 cellule per 200 microlitri per pozzetto.
Utilizzando un pipeter multicanale. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aspirare il surnatante dai pozzetti usando una pipetta di pascolo di vetro collegata a una pompa per vuoto.
Dosare le cellule in triplice copia con i composti in esame utilizzando le soluzioni di lavoro precedentemente preparate. Quindi restituire le cellule all'incubatore. Dopo 24 ore, aspirare il surnatante dai pozzetti e aggiungere 200 microlitri di soluzione MTT a ciascun pozzetto.
Incubare il piatto per quattro ore. Aspirare delicatamente il surnatante dai pozzetti senza disturbare i cristalli viola formazane. Aggiungere 200 microlitri di DMSO a ciascun pozzetto per sciogliere i cristalli.
Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Misurare l'assorbanza per ciascun pozzetto a 590 o 600 nanometri utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. Utilizzare pozzetti senza celle come sfondo e calcolare la media del valore di assorbanza.
Le cuciture gox spirocicliche sei e sette sono state sintetizzate utilizzando un protocollo modificato. Il progresso della reazione è stato monitorato rilevando la scomparsa dell'alfa beta insatura Esther utilizzando la spettroscopia infrarossa. Il test MTT è stato utilizzato per determinare la vitalità cellulare.
Il cisplatino, che è noto per indurre la morte cellulare ad alte concentrazioni, è servito come controllo positivo. Come previsto, maggiore è la concentrazione di cisplatino, minore è la vitalità cellulare. Il test MTT è stato quindi utilizzato per testare i composti spirociclici sei e sette e la furfurilammina.
La furfurilammina e la cucitura spirociclica gox six hanno mostrato citotossicità simile. Tuttavia, la tossicità del composto spirociclico sette era notevolmente maggiore di quella della furfurilammina e sei. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la N-alchilazione eseguita utilizzando alogenuri acilici voluminosi è stata trovata per ridurre il tasso di eliminazione beta riducendo così la resa del prodotto.
