Этот протокол использует перерабатываемый и модифицированный метод получения спироциклических соединений. Анализ MTT помогает ответить на вопрос, касающийся цитотоксичности этих новых молекул. Этот метод производит новые модифицируемые молекулы с использованием регенерирующего исходного материала.
Анализ MTT обеспечивает относительно быстрые и простые для анализа биологические результаты Начните с выполнения твердофазного синтеза спироциклических гетероциклов шесть и семь, как было продемонстрировано ранее. Приготовьте 20 миллилитров пяти миллиграммов на миллилитр раствора МТТ, используя стерильный PBS в качестве разбавителя. Отфильтруйте и храните раствор при минус 20 градусах Цельсия.
Затем приготовьте один к одному разведение раствора МТТ в ДМЭМ. Готовят по одному миллилитру каждого из исходных растворов в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках исследуемых соединений в ДМСО. Храните их при минус 20 градусах Цельсия.
Готовят 200 микролитров на дозу рабочих растворов исследуемых соединений путем разбавления исходных концентраций. От одного до 1000 в свободной от сыворотки среде. В семенах тканевой культуры семь клеток COS в полной среде на плоской нижней тканевой культуре обрабатывали 96 пластин лунки в концентрации 4000 клеток на 200 микролитров на лунку.
Использование многоканального трубоукладчика. Инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. На следующий день аспирируйте супернатант из скважин с помощью стеклянной пастбищной пипетки, прикрепленной к вакуумному насосу.
Дозируйте клетки в трех экземплярах с исследуемыми соединениями, используя предварительно приготовленные рабочие растворы. Затем верните клетки в инкубатор. Через 24 часа аспирировать супернатант из скважин и добавить в каждую скважину 200 микролитров раствора МТТ.
Инкубируйте пластину в течение четырех часов. Осторожно аспирируйте супернатант из лунок, не нарушая фиолетовые кристаллы формазана. Добавьте 200 микролитров ДМСО в каждую лунку, чтобы растворить кристаллы.
Затем инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 15 минут. Измерьте поглощение для каждой скважины при 590 или 600 нанометрах с помощью считывателя пластин 96 скважин. Используйте скважины без ячеек в качестве фона и усредняйте значение поглощения.
Спироциклические гоксовые швы шесть и семь были синтезированы с использованием модифицированного протокола. Ход реакции контролировали путем обнаружения исчезновения альфа-бета-ненасыщенной Эстер с помощью инфракрасной спектроскопии. Анализ MTT использовался для определения жизнеспособности клеток.
Цисплатин, который, как известно, индуцирует гибель клеток при высоких концентрациях, служил положительным контролем. Как и ожидалось, чем выше концентрация цисплатина, тем ниже жизнеспособность клеток. Затем анализ MTT был использован для тестирования спироциклических соединений шесть и семь и фурфуриламин.
Фурфуриламин и спироциклический гоксовый шов шесть показали сходную цитотоксичность. Однако токсичность спироциклического соединения семь была заметно больше, чем у фурфуриламина и шести. При попытке этого протокола имейте в виду, что N-алкилирование, выполненное с использованием громоздких ацилгалогенидов, как было обнаружено, снижает скорость бета-элиминации, тем самым уменьшая выход продукта.
