שיטה זו מאפשרת למדוד את התפלגות הזמן המרחבית של הכוחות המוחלים על ידי תאי B בסינאפזה החיסונית ולתאם אותם עם גיוס חלבונים ספציפיים. מיקרוסקופ כוח המתיחה באמצעות ג'לים פוליאקרילמיד קל ליישם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להגדיר במהירות את המדידה של היכולות המכאניות של תאי B רבים.
שיטה זו היא גמישה והוא יכול להיות מותאם גרף ליגנדים אחרים כמו integrins או ללמוד סוגים אחרים של סינפסות החיסון כמו תאי T או phagocytosis מתוסכל. בשל המאפיינים הפיזיים והכימיים של הג'לים הנדרשים על ידי ניסוי זה, ההתאמה של שיטות מיקרוסקופיות כוח המתיחה הקלאסי לתאי B עשויה להיות מסובכת. התחל על ידי מליחות התמיכה ג'ל.
הפעל את כיסוי או צלחת פטרי התחתון זכוכית עם מנורת UV במשך שתי דקות, ולאחר מכן salinize אותו עם 200 microliters של APTMS במשך חמש דקות. זה יכין את התמיכה עבור כריכה קווולנטית של הג'ל. לשטוף ביסודיות את המכסה או צלחת תחתית זכוכית עם מים טהורים במיוחד ולייבש אותו באמצעות שאיפת ואקום.
כדי להכין את כיסויים לשטח את הג'ל, לשים אותם לתוך מחזיק כיסוי קרמיקה, לשים את המחזיק בסקילר קטן, ויוצקים reagent סיליקון על coverlips הקפד לכסות אותם לחלוטין. מכסים את המזימה בנייר אלומיניום ומשאירים אותה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. בינתיים, למלא מקור גדול עם מים טהורים במיוחד.
לאחר שלוש דקות של דגירה בריג'נט סיליקון, מעבירים את מחזיק הכיסויים עם כיסויים לתוך הבועה עם מים. שטפו היטב את הכיסויים במים טהורים במיוחד. מייבשים אותם היטב ומ מניחים אותם על מגבוני נייר.
לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מיד להמשיך עם פולמריזציה ג'ל. מכינים 500 ג'ל פסקל מראש לערבב על פי הוראות כתב יד, ולאחר מכן לשלב 167 microliters של מראש לערבב עם 1.67 microliters של חרוזים. מערבולת ו sonicate את התערובת ב sonicator אמבטיה במשך חמש דקות.
הגן על התערובת מפני אור עם רדיד אלומיניום. כדי להפוך את הפילמור לרישי, הוסיפו 1.67 מיקרוליטרים של 10%אמוניום משכנעים לתערובת הג'ל, ולאחר מכן ייזמו פילמיזציה על ידי הוספת 0.2 מיקרוליטרים של TEMED וערוב הג'ל עם פיפטה. כדי להטיל את הג'ל, פיפטה תשעה microliters של ג'ל לערבב על כל כיסוי מליחות או צלחת תחתונה זכוכית.
מיד לשטח את הג'ל עם כיסוי סיליקון, לחיצה עליו עם מדחפים כדי להבטיח כי הג'ל מתפשט על פני כל האזור של coverslip וש חלק ממנו דולף החוצה. הפוך את המכסה או צלחת תחתית זכוכית לתוך צלחת פטרי גדולה והקש אותו על הספסל כדי לכפות את חרוזים לכיוון משטח הג'ל. מניחים רקמה לחה על המנה כדי ליצור תא רטוב.
מכסים אותו בנייר אלומיניום ומגרים אותו במשך שעה. לאחר הדגירה, להקל על שחרור coverslip על ידי הוספת PBS לדגימה. בזהירות להסיר את הכיסוי עם מחט, מעט הטיית המנה אבל לוודא כי הג'ל הוא שקוע PBS.
סוכן הסיליקון, אקרילאמיד, אקרילאמיד בסיסי ו- TEMED יכול להיות רעיל על ידי שאיפה. ללבוש ציוד מגן אישי סטנדרטי ולתפעל מוצרים אלה תחת מכסה המנוע כימי. שאפו את ה-PBS מהג'לים והוסיפו 150 מיקרוליטרים של סולפו-SANPAH בטמפרטורת החדר.
לחשוף את הג'ל לטיפול UV במשך שתי דקות, ולאחר מכן לשטוף את הג'ל שלוש פעמים עם PBS. חזור על הטיפול עם סולפו-SANPAH ואת שטיפות PBS, ולאחר מכן להוסיף 250 microliters של תן ביצה lysozyme או HEL לג'ל דגירה אותו לילה בתא לחות בארבע מעלות צלזיוס מכוסה רדיד אלומיניום. לאחר הדגירה, להסיר את אנטיגן HEL ולשטוף את הג'ל עם PBS שלוש פעמים.
לבסוף, לכסות את הג'ל עם 500 microliters של מדיה תרבות תא B ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר. השתמש במיקרוסקופ קונפוקל עם בקרת תרמית ופחמן דו חמצני להדמיה. שאף את התקשורת מהג'ל, והשאיר כ-200 מיקרוליטרים.
מקם את הג'ל על המיקרוסקופ. שתי שכבות עיקריות של חרוזים יופיעו בחלק התחתון והחלק העליון של הג'ל. התמקדו במישור הג'ל ותמצאו אזור שווה לתמונה.
בחרו את אזור ההדמיה בקפידה ודאגו להישאר בפוקוס. צפיפות חרוזים מתאימה ומשטח אחיד הם המפתח להשגת מדידות כוח חזקות ואמינות. הוסף 80 microliters של לימפוציטים B ראשוני מעכברי MD4 לג'ל, הימנעות לגעת בג'ל כדי לשמור על המיקוד.
ודא שהמוקד עדיין נכון ושניתן לראות תאים יורדים באזור. הפעל את הרכישה לפני התאים להגיע לג'ל. פתח את הסרט כערימת תמונות ב- ImageJ ולאחר מכן הפעל את חיתוך המאקרוandsave.ijm.
בחר ספריית פלט וקבע את תצורת הגדרות ערוץ התכונה. בחר את אזורי העניין באמצעות הכלי מלבן והוסף אותם לרשימת ההשקעות באמצעות מקש T. כשתסיים, לחץ על אישור. כאשר המאקרו מציע מסיכה של התא, לחץ על אישור אם הוא משביע רצון.
אם לא משביע רצון, לחץ על לא אישור ולאחר מכן בחר ידנית אזור סגור עם כלי בחירה כלשהו ולאחר מכן לחץ על המשך. פתח את MATLAB והפעל את tfmv1.m. הזן את הפרמטרים הדרושים.
באופן ספציפי, בדוק מאפייני תמונה, כגון גודל פיקסל ומרווח זמן הרכישה ומאפייני הג'ל כגון מודולוס E צעיר ויחס פואסון. בסיום, אתר את פלטי התוכנה באותה ספריה שבה נמצא הקובץ המקורי. תמונות חרוזים נכונות נראות כמו חלוקה אחידה ואקראית של כתמים בהירים הדומים לשמיים כוכבים.
נתונים וניתוח אינם אמינים כאשר מספר חרוזים נמוך מדי או שהתמונה אינה ממוקדת. ניתן להתבונן בתנועת חרוזים בעין באמצעות מסגרת התייחסות שקדמה למגע הראשון של התא עם המצע. ניתן להשיג תוצאות משוערות ממעקב אחר חלקיקים בודדים.
הניתוח מספק פילוח של חרוזים בתדמית ההפניה כפקד. באמצעות תוכנה, ניתן גם להשיג את שדה התזוזה והלחץ, שהוא הווקטור של הלחץ המקומי בכל פיקסל ובכל נקודת זמן. תוצר סקלרי של שדות ההנעה והכוח המשולבים באזור התא מספק את העבודה הכוללת המופעלת על-ידי התא במצע.
בעת השוואת שני מצבים ביולוגיים, ניתן לחשב עקומה ממוצעת או ערך ממוצע בנקודות הזמן האחרונות שבהן האנרגיה מגיעה לרמה. כאשר מידע מרחבי של הכוחות רלוונטי, ניתן גם להשוות נקודות זמן בודדות של כל תנאי. דוגמה של אנטיגן פלואורסצנטי מיצוי זמן לשגות מוצג כאן.
המראה המתקדם של אותות פלואורסצנטיים בסינאפסה מצביע על ניתוק אנטיגן מהג'ל. ניתן להשתמש בנתונים הפלואורסצנטיים כדי לבנות עקומת מיצוי ממוצעת. הצעד העדין ביותר בפרוטוקול הוא פולמריזציה של הג'ל מתחת לכיסוי.
שלב זה חייב להתבצע במהירות יחסית בזהירות להבטיח כי הג'ל נסחט באופן אחיד מתחת לכיסוי. בעקבות הליך זה, חלבון פלואורסצנטי המבטא לימפוציטים B יכול לשמש כדי להעריך בו זמנית את לוקליזציה של מבנים תאיים דפוס כוח. טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם הפרעות גנטיות או כימיות כדי להעריך את התפקיד של חלבונים ספציפיים על התכווצות התא ספיגת אנטיגן.
