בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות

הבידוד של אנדותל המסתם הראשוני האנושי והתא הבין-תאי הוא קריטי להבנת המנגנון הבסיסי של הפתוגנזה של מחלת המסתם האאורטלי הקלציפי. כאשר השסתום נכרת מהרקמה המקורית, כדאיות התא יורדת. לכן זיהינו שיטה שמאריכה את כדאיות התאים.

לאחר קבלת דגימות רקמת המסתם שחולץ, חלצו את שורש אבי העורקים והטביעו את הרקמה בצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל תמיסת שטיפה סטרילית. לאחר דגירה של 10 דקות בדלי קרח על נדנדה, יש לרסס את הצינורות ב-70% אתנול. בקולט אדים סטרילי של תרבית רקמה, מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי ומוציאים שני עלוני שסתום.

מניחים עלון אחד בבקבוקון קריוגני ומקפיאים את הרקמה בחנקן נוזלי לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לתקן את הרקמה לצביעת תכולת הסידן, חתכו את העלון השני לשניים מגולם לציר והכניסו את שתי חתיכות הרקמה לקלטת השקועה ב-4% פרפורמלדהיד. לאחר מכן הניחו את כל המערך על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך מינימום של שעתיים אך לא יותר מארבע שעות.

כדי לבודד תאים אינטרסטיציאליים של שסתום, העבירו את העלון לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר המכיל PBS קר כקרח, והניחו את הצינור על נדנדה למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הערבוב, מעבירים את הרקמה לצלחת של 60 מילימטר המכילה חמישה עד שבעה מיליליטר של תמיסת קולגן קרה. השתמש במלקחיים כדי לטבול את שני צידי העלון שלוש עד ארבע פעמים לתוך התמיסה לפני דגירה של הרקמה באינקובטור תרבית התאים במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה של הרקמה שלוש עד ארבע פעמים כל שתי דקות.

בסוף הדגירה, להעביר שני מיליליטר של תמיסה מן המנה צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי. הנחת מלקחיים על גולם העלון, השתמש במקלון צמר גפן סטרילי כדי להחליק את הרקמה מהמלקחיים אל הציר תוך כדי סיבוב המטוש לאורך העלון. לאחר ההחלקה, שטפו את המטוש בצינור של תמיסת הקולגן וטבלו את הצד השני של הרקמה כפי שהוכח זה עתה.

לאחר השטיפה, חזור על המטוש משני צידי הרקמה והשתמש בתמיסת פיפטה של מיליליטר אחד ותמיסת קולגן כדי לשטוף את כל תאי הניתוק משני צידי משטח העלון לתוך המנה. לאחר השטיפה, מעבירים את כל התמיסה מהתמיסה לצינור המכיל את התאים מהמטוש ומניחים את רקמת השסתום הנותרת בצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר המכיל שבעה מיליליטר של תמיסת קולגן סטרילית. גלולה את תאי האנדותל של המסתם המבודד על ידי צנטריפוגה והשהה את כדור התא בשלושה מיליליטר של מדיום צמיחת תאי אנדותל וסקולרי.

לאחר צנטריפוגה שנייה, יש להשעות את התאים במיליליטר אחד של מדיום גדילה טרי לצורך ספירה ולזרוע את התאים בריכוז של 5 על 10 עד 5 לסמ"ר בתאים מרובעים בצלחות מצופות קולגן של שש בארות, תוך רענון המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים. כאשר מדבקות תאי האנדותל של המסתם מכסות יותר מ-80% מהצלחת, פצלו את התאים בריכוז של 1.3 על 10 לתאים הרביעיים בסנטימטר מרובע, בהתאם לקצב הגדילה שלהם. לאחר שהתאים הורחבו, אשרו את הפנוטיפ של תאי האנדותל של המסתם שלהם על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית עבור סמנים מעניינים של תאי אנדותל.

כדי לבודד את התאים הבין-תאיים של המסתם, הכניסו את הצינור המכיל את המטוש לרקמת העלון לתוך אינקובטור תרבית התאים למשך 12 עד 18 שעות כשהפקק פתוח מעט. בסוף הדגירה, השתמש פיפטה סרולוגית כדי לנתק בעדינות את הרקמה כדי להבטיח שחרור של תאים interstitial שסתום ולסנן את תרחיף התא דרך מסננת 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף שבעה מיליליטר של מדיום תאים interstitial שסתום לצינור ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

יש להשעות את הכדור במיליליטר אחד של מדיום צמיחת תאים אינטרסטיציאליים של שסתום טרי לצורך ספירה וזרע את התאים בריכוז של 1.3 x 10 מהתאים הרביעיים לסנטימטר מרובע בצלחת מטופלת בתרבית רקמה בקוטר 60 מילימטר. לאחר יום-יומיים, לשטוף את התרביות פעמיים עם PBS ולהוסיף מדיום טרי לתאים. כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, שטפו את התרביות פעמיים עם DPBS וטפלו בתאים עם שניים עד שלושה מיליליטרים של מגיב דיסוציאציה שחומם מראש במשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כאשר התאים התנתקו, העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי לצנטריפוגה והניחו בעדינות את הכדור בשלושה עד ארבעה מיליליטרים של מדיום צמיחת תאים אינטרסטיציאליים של שסתום שחומם מראש לספירה. לאחר מכן זרעו את התאים ביחס של אחד עד שניים לצפיפות התרבית המקורית והעריכו את פנוטיפ צמיחת התאים הבין-תאיים על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית כפי שהוכח. דגימות רקמת מחלה של מסתם אבי העורקים קלציפיק מציגות מורפולוגיה שונה עם גושים כבדים של הסתיידות בהשוואה לדגימות רקמה לא מזוהמות בקרה.

כאשר ההסתיידות מוערכת על ידי מכתים פון קוסה, משקעים חומים כהים או שחורים נצפים ברקמת העלון החולה. תמיסת אחסון קר מייצבת במידה רבה את תאי רקמת המסתם שנכרתו עם כדאיות של כ-40% שנצפתה עבור שני סוגי התאים המשוחזרים עד 61 שעות לאחר מיצוי המסתם. ניתוח מורפולוגי של תאי האנדותל של המסתם חושף מגע גדילה דמוי אבן דחוסה של תאים מעוכבים, בעוד שתאי הביניים של המסתם מדגימים מורפולוגיה בצורת ציר הדומה לזו שנצפתה עבור מיופיברובלסטים.

Immunostaining מאשר כי רוב התאים האנדותל המורחבת ותאי הביניים של המסתם מבטאים את הסמנים הספציפיים לרקמות הצפויות. זכרו כי שפשוף עדין אך יציב של העלון הוא קריטי לשחרור שכבת תאי האנדותל, וכי הדגירה הלילה עם קולגן נדרשת לשחרור אוכלוסיית התאים הבין-תאיים מתוך הרקמה הצפופה. לאחר שקווי התאים נקבעו, הם יכולים לשמש למחקר מכני לגבי פתוגנזה ספציפית של מחלת מסתם אבי העורקים, כולל התפרצות מחלה, התקדמות וטיפול.