כאלמנט מינרלי חשוב, סידן ממלא תפקיד מרכזי בצמיחה ובקרת האיכות של פירות עץ כגון תפוח, הוא יכול לווסת את הקשיות, תכולת הסוכר, תקופת האחסון וההפרעה הפיזיולוגית במהלך האחסון. הדמיית סידן היא השיטה המערבית ביותר לזיהוי שינויים דינמיים ביוני הסידן בציטופלסמה. אינדיקטורים פלואורסצנטיים מולקולה קטנה, כגון פלואו-4/AM יש סלקטיביות ספציפית סידן יון והוא יכול להיות טעון באופן לא פולשני על ידי דגירה אסטריפיקציה, שהיא גמישה, מהירה, ולא ציטוטוקסית.
פרוטוקול זה יציג שיטה לטעינת פלואו פלואורסצנטי פלואורסצנטי כימי מולקולה קטנה לתוך פרוטופלסטים צמחיים. מיצוי פרוטופלסט להוסיף 0.5 מיליליטר של פתרון אנזימים לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. בחר תפוח בריא ובשלים, ולאחר מכן לפרוס את עיסת לתוך 10 פעמים 5 כפול 1 מיליליטר מעוקב גודל.
מניחים את חתיכות עיסת לתוך פתרון אנזימטי, ולאחר מכן לסגור את הצינור. צינור דגירה ב-28 מעלות לשעה אחת. כבול ב-70 סל"ד בחושך.
לאחר מכן, לשטוף את חתיכות עיסת, לשאוף את כל הפתרון אנזימטי ולאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר פתרון בסיסי. צנטריפוגה במהירות של 300 גרם במשך 2 דקות. השעיית פרוטופלסטס ניתן להשיג על ידי שאיפה הפתרון התחתון.
כתמי פלואורסצנטיות כימית של מולקולה קטנה. הכן את פתרון הטעינה פלו-4/AM עם פלואו-4/AM 2 מילימולרים, 20%אתיל127, ואת תמיסת מלח 10X פוספט חוצץ ביחס אחד עד שניים. הוסף פתרון טעינת מיקרוליטר אחד של מתלה פרוטופלסט פלואו-4/AM ל-99 מיקרו-ליטר.
הריכוז הסופי של צבעי פלואורסצנטי הוא 5 מיקרומולר. מערבבים את הפתרון ואז סוגרים את הצינור. במקביל, לנתנום מגהץ את הסידן או הייחודיות של חומר הפלואורסצנטי הכימי המולקולרי הקטן.
הוסף מיקרוליטר אחד או 10 מיקרוליטר ברזל לנתנום יותר ולאחר מכן פתרון טעינה מיקרוליטר אחד של פלואו-4/AM ל 98 השעיית פרוטופלסטות מיקרוליטר. הריכוז הסופי של ברזל לנתנום הוא 100 מיקרומולר. מערבבים את הפתרון ואז סוגרים את הצינור.
דגירה ב-37 מעלות במשך 30 דקות בחושך. לאחר מכן, צנטריפוגה במהירות של 300 G במשך שתי דקות. שאפו לפתרון 17 מיקרוליטרים והוסיפו פתרון בסיסי של 17 מיקרוליטרים.
לדגור על ההשעיה protoplast ב 37 מעלות במשך 30 דקות כדי לחלוטין לאחר מכן, לשאוף 50 השעיית פרוטופלסט מיקרוליטר לטפטף על שקופית. שימו לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. בחר את ה- 20x את ההגדלה ואת ערוץ GFP לצפייה.
כוונן באופן אחיד את הבהירות ל- 0.5. צעד קריטי בשיטה המוצעת היא לשטוף את הכתם בפרוטופלסטים ולדגירה אותם במשך 30 דקות. כביסה לא מספקת גורמת לגיבוי מוגזם על הפלואורסצנטיות במהלך התצפית והדגירה מאפשרת טעינה טובה יותר או בדיקה לתוך הציטופלסמה.
Protoplasts קיימא Assay קח 99 מיקרוליטר protoplasts השעיה לאחר דגירה ב 37 מעלות במשך 30 דקות. יש להוסיף 1 מ"ל בפתרון ה-FD להשעיית פרוטופלסטס. מערבבים את הפתרון על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים ולאחר מכן לסגור את הצינור.
הישאר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות בחושך. הכן את השקופיות והתבונן בהן במיקרוסקופ הפלואורסצנטי עם ערוץ GFP. אנו מציגים בפניכם תוצאות בהתאם לאיור הראשון.
אנו משתמשים בשיטה אנזימטית כל קבלת פרוטופלסטים מן העיסה. לחלק מהנורות היה חלול בעוד שאחרים לא. הפרוטופלסטים היו מוכתמים ב- FD במשך חמש דקות ומראים את פלורסנט בציטופלסמה המציינת כי טמפרטורה גבוהה, 37 מעלות אינה משפיעה על הכדאיות או הפרוטופלסטים איור 2.
הפרוטופלסטים לא הראו שום פלואורסצנטיות באחד ממחווני הפלואורסצנטיות של ברזלי הסידן או שהוא לא טעון לתוכם. מאשר בפלואו-4/AM הועמס לתוך הפרוטופלסט, הציטופלסט, אבל לא חלול הפך לפלורסנט. מגהצי לנתנום אשר חוסמים ביעילות תעלות סידן הם קרום התא נוספו לטעינת פלואו-4/AM Protoplast.
בריכוז הסופי של 100 מגהצי לנתנום מיקרומולרים מפחיתים באופן משמעותי את עוצמת הפלואורסצנטיות של הסידן. התוצאה הזו הראתה עוד כי פלואו-4/AM נשארים ביעילות בברזלי הסידן בציטופלסט והוא מראה שינויים דינמיים בתכולת ברזלי הסידן. איור 3 תוצאות פלואו-4/AM נותחו באמצעות IMH שאושר בתוספת 6.0 תוכנה fluo-4/AM מכתים עם תוספת של מגהצי לנתנום הפחית באופן משמעותי את ערך פלורסנס של מגהצי סידן ציטופלסמיים.
בסרטון זה, היו כל הפרוטופלסטים הושגו על ידי הידרוליזה אנזימטית. העמסנו בהצלחה את הבדיקות הפלואורסצנטיות לפרוטופלסטים ב-37 מעלות. יתר על כן, השיטה לא השפיעה על הכדאיות של protoplasts.
לסיכום, השיטה המתוארת כאן בפירוט רב. השינויים הדינמיים ביוני סידן ציטופלסמיים בתאי עיסת התפוחים ובכך מספקים 10 תומכים שווים למטרה נוספת של מחקרים הקשורים לסידן.
