Как важный минеральный элемент, кальций играет ключевую роль в росте и контроле качества плодов деревьев, таких как яблоко, он может регулировать жесткость, содержание сахара, срок хранения и физиологическое расстройство во время хранения. Визуализация кальция является наиболее западным методом обнаружения динамических изменений ионов кальция в цитоплазме. Маломолекулярные флуоресцентные индикаторы, такие как флуо-4/AM, обладают селективностью, специфичной для ионов кальция, и могут быть неинвазивно загружены путем этерификационной инкубации, которая является гибкой, быстрой и нецитотоксичной.
Этот протокол введет метод загрузки маломолекулярного химического флуоресцентного реагента fluo-4/AM в протопласты растений. Экстракция протопласта Добавьте 0,5 миллилитра раствора фермента в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Выберите здоровое и спелое яблоко, затем нарежьте мякоть в 10 раз 5 раз по 1 кубический миллилитр.
Поместите кусочки мякоти в ферментативный раствор, затем закройте трубку. Инкубировать трубку при 28 градусах в течение одного часа. Забит при 70 об/мин в темноте.
После этого промыть кусочки мякоти, аспирировать весь ферментативный раствор и затем добавить 0,5 миллилитра основного раствора. Центрифуга со скоростью 300 г в течение 2 мин. Суспензию протопластов можно получить путем аспирации нижнего раствора.
Окрашивание маломолекулярного химического флуоресцентного реагента. Приготовьте раствор для загрузки флуо-4/AM с 2 миллимолярными флуо-4/AM, 20%этил127 и 10X фосфат-буферным физиологическим раствором в соотношении один к одному к двум. Добавьте 1 микролитр нагрузочного раствора флуо-4/AM к 99 микролитрам суспензии протопласта.
Конечная концентрация флуоресцентных красителей составляет 5 микромолярной. Перемешайте раствор, затем закройте трубку. В то же время железо лантана является кальцием или уникальностью мелкомолекулярного химического флуоресцентного агента.
Добавьте еще один микролитр или еще 10 микролитр железа лантана, а затем один микролитр нагрузочного раствора флуо-4/AM до 98 микролитровой суспензии протопластов. Конечная концентрация железа лантана составляет 100 микромолярной. Перемешайте раствор, затем закройте трубку.
Инкубировать при 37 градусах в течение 30 минут в темноте. После этого центрифугируют со скоростью 300 G в течение двух минут. Аспирировать до 17 микролитров раствора и добавить 17 микролитр основного раствора.
Инкубируют суспензию протопласта при 37 градусах в течение 30 минут до полного после этого аспирируют 50 микролитров суспензии протопластов и капают на горку. Наблюдать под флуоресцентной микроскопом. Выберите 20-кратное увеличение и канал GFP для наблюдения.
Равномерно отрегулируйте яркость до 0,5. Критическим этапом в этом предложенном способе является промывка пятна в протопластах и инкубирование их в течение 30 минут. Недостаточная промывка вызывает чрезмерную флуоресценцию во время наблюдения, а инкубация позволяет лучше загрузить зонд в цитоплазму.
Протопопласты Анализ жизнеспособности Берут 99 микролитров суспензии протопластов после инкубации при 37 градусах в течение 30 минут. Добавьте 1 мл в раствор FD к суспензии протопластов. Перемешайте раствор, несколько раз пипетируя вверх и вниз, а затем закройте трубку.
Оставайтесь при комнатной температуре в течение пяти минут в темноте. Подготовьте слайды и наблюдайте за ними на флуоресцентной микроскопе с каналом GFP. Представляем вам результаты На следующем рисунке один.
Мы используем ферментативный метод, все получение протопластов из пульпы. У некоторых протопластов была вакуоль, в то время как у других ее не было. Протопласты окрашивали ФД в течение пяти минут и показывали флуоресценцию в цитоплазме, указывая на то, что высокая температура, 37 градусов не влияет на жизнеспособность или протопласты Рисунок второй.
Протопласты не проявляли флуоресценции в одном из индикаторов флуоресценции кальциевых желез или не загружались в них. Чем в флуо-4/АМ загружали в протопласт, цитопласт, но не вакуоль становился флуоресцентным. Лантановые железа, которые эффективно блокируют кальциевые каналы клеточной мембраны, были добавлены к нагрузке Fluo-4/AM Protoplast.
При конечной концентрации 100 микромолярный железо лантана значительно снижает интенсивность флуоресценции кальция. Эти результаты также продемонстрировали, что флуо-4 / AM эффективно остаются в железах кальция в цитопласте и показывают динамические изменения в содержании кальциевых желез. Результаты fluo-4/AM были проанализированы с использованием одобренного IMH плюс 6.0 программного флюо-4/AM окрашивания с добавлением лантановых желез значительно снижало значение цветения цитоплазматических кальциевых желез.
В этом видео все протопласты были получены ферментативным гидролизом. Мы успешно загрузили флуоресцентные зонды в протопласты при 37 градусах. Более того, метод не повлиял на жизнеспособность протопластов.
Вкратце, метод, описанный здесь в натуральной форме, подробно. Динамические изменения цитоплазматических ионов кальция в клетках яблочной мякоти тем самым обеспечивают 10 равных опор для дальнейшей цели исследований, связанных с кальцием.
