Önemli bir mineral element olarak kalsiyum, elma gibi ağaç meyvelerinin büyümesinde ve kalite kontrolünde kilit rol oynar, depolama sırasında sertliği, şeker içeriğini, depolama süresini ve fizyolojik bozukluğu düzenleyebilir. Kalsiyum görüntüleme sitoplazmadaki kalsiyum iyonlarındaki dinamik değişiklikleri tespit etmek için en batılı yöntemdir. Fluo-4/AM gibi küçük molekül floresan göstergeleri kalsiyum iyona özgü seçiciliğe sahiptir ve esnek, hızlı ve sitotoksik olmayan esterleşme inkübasyonu ile noninvaziv olarak yüklenebilir.
Bu protokol, küçük moleküllü kimyasal floresan reaktif fluo-4/AM'nin bitki protoplastlarına yüklenmesi için bir yöntem getirecektir. Protoplast Ekstraksiyonu 1,5 mililitre santrifüj tüpüne 0,5 mililitre enzim çözeltisi ekleyin. Sağlıklı ve olgun bir elma seçin, ardından hamuru 10 kez 5 kez 1 kübik mililitre boyutunda dilimleyin.
Hamur parçalarını enzymatic çözeltiye yerleştirin, ardından tüpü kapatın. Tüpü bir saat boyunca 28 derecede kuluçkaya yatır. Karanlıkta 70 rpm'de zincirlenmiş.
Bundan sonra, hamur parçalarını yıkayın, tüm enzymatic çözeltiyi epire edin ve ardından 0,5 mililitre temel çözelti ekleyin. 2 dakika boyunca 300 g hızında santrifüjleyin. Protoplast süspansiyonu alt çözeltiyi özendirerek elde edilebilir.
Küçük moleküllü kimyasal floresan reaktif boyama. Fluo-4/AM yükleme solüsyonını 2 milimolar fluo-4/AM, %20 etil127 ve 10X fosfat tamponlu salin ile bir ila bir ila iki oranında hazırlayın. 99 mikroliter protoplast süspansiyona 1 mikroliter yükleme solüsyonu fluo-4/AM ekleyin.
Floresan boyaların son konsantrasyonu 5 mikromolardır. Çözeltiyi karıştırın ve tüpü kapatın. Aynı zamanda, lantıran küçük moleküler kimyasal floresan ajanın kalsiyum veya benzersizliğini ütüler.
Bir mikroliter veya 10 mikroliter daha fazla lantıran gazı ve ardından fluo-4 / AM'den 98 mikroliter protoplast süspansiyona bir mikroliter yükleme çözeltisi ekleyin. Lantıranum demirinin son konsantrasyonu 100 mikromolardır. Çözeltiyi karıştırın ve tüpü kapatın.
Karanlıkta 30 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yaslanın. Bundan sonra, iki dakika boyunca 300 G hızında santrifüjleyin. 17 mikrolitre çözeltiye aspire edin ve 17 mikrolitre temel çözelti ekleyin.
Protoplast süspansiyonu 37 derecede 30 dakika boyunca tamamen kuluçkaya bırakın, bundan sonra 50 mikroliter protoplast süspansiyonu epire edin ve bir kaydırağa damlatın. Floresan mikroskop altında gözlemleyin. Gözlemlenmesi gereken 20x büyütmeyi ve GFP kanalını seçin.
Parlaklığı 0,5'e eşit olarak ayarlayın. Önerilen bu yöntemde kritik bir adım, lekeyi protoplastlarda yıkamak ve 30 dakika kuluçkaya yatırmaktır. Yetersiz yıkama, gözlem ve inkübasyon sırasında floresan üzerinde aşırı destek sağlar, sitoplazma daha iyi yüklenmesini veya probu sağlar.
Protoplastlar Uygulanabilirlik Tahlil 30 dakika boyunca 37 derecede inkübasyondan sonra 99 mikroliter protoplast süspansiyonu alın. Protoplast süspansiyona FD çözümüne 1 ml ekleyin. Çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle karıştırın ve ardından tüpü kapatın.
Karanlıkta beş dakika oda sıcaklığında kalın. Slaytları hazırlayın ve GFP kanalı ile floresan mikroskopta gözlemleyin. Sonuçları size sunuyoruz Şekil 1'in ardından.
Enzimmatik yöntemi kullanıyoruz hepsi pulpadan protoplastlar elde ediyor. Bazı protoplastlarda vakuol, bazılarında ise yoktu. Protoplastlar beş dakika boyunca FD ile boyandı ve yüksek sıcaklığın, 37 derecenin canlılığı veya protoplastları etkilemediğini gösteren sitoplazma floresanını gösterdi Şekil iki.
Protoplastlar kalsiyum ütü floresan göstergesinden birinde floresan sergilemedi veya bunlara yüklenmedi. Fluo-4/AM'dekinden daha fazla protoplast içine yüklendi, sitoplast, ancak bir vakuol floresan olmadı. Kalsiyum kanallarını etkili bir şekilde bloke eden lantıran ütüler, Protoplast fluo-4/AM yüklemesine hücre zarı olarak eklenmiştir.
100 mikromoler lantalaum demirinin son konsantrasyonu kalsiyum floresan yoğunluğunu önemli ölçüde azaltır. Bu sonuçlar ayrıca fluo-4/AM'nin sitoplasttaki kalsiyum demirlerinde etkili bir şekilde kaldığını ve kalsiyum demir içeriğinde dinamik değişiklikler gösterdiğini göstermiştir. Şekil 3 Fluo-4/AM sonuçları, lantıran ütülerinin eklenmesiyle IMH onaylı artı 6.0 yazılım fluo-4/AM boyama kullanılarak analiz edildi ve sitoplazmik kalsiyum demirlerinin floresan değerini önemli ölçüde azalttı.
Bu videoda, tüm protoplastlar enzimatik hidroliz ile elde edildi. Floresan probları 37 derecede bir protoplastlara başarıyla yükledik. Dahası, yöntem protoplastların canlılığını etkilemedi.
Özetle, burada ayni olarak açıklanan yöntem ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Elma hamuru hücrelerindeki sitoplazmik kalsiyum iyonlarındaki dinamik değişiklikler, böylece kalsiyumla ilgili çalışmaların daha fazla amacı için 10 eşit destek sağlar.
