중요한 미네랄 요소로서 칼슘은 사과와 같은 나무 과일의 성장과 품질 관리에 중요한 역할을 하며, 저장 시 경도, 당도, 저장 기간 및 생리장애를 조절할 수 있다. 칼슘 이미징은 세포질에서 칼슘 이온의 동적 변화를 감지하는 가장 서쪽 방법입니다. 형광4/AM과 같은 소분자 형광 지표는 칼슘 이온 특이적 선택성을 가지며 유연하고 신속한 비세포 독성인 에스테르화 인큐베이션에 의해 비침습적으로 적재될 수 있습니다.
이 프로토콜은 소분자 화학형 시약 플루오-4/AM을 식물 성층세포에 적재하는 방법을 소개합니다. 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 효소 용액0.5 밀리리터를 추가합니다. 건강하고 잘 익은 사과를 선택한 다음 펄프를 10배 5배 1입방 밀리리터 크기로 자른다.
펄프 조각을 효소 용액에 넣은 다음 튜브를 닫습니다. 1 시간 동안 28도에서 튜브를 인큐베이션합니다. 어둠 속에서 70 rpm에 구타.
그 후 펄프 조각을 씻고 모든 효소 용액을 흡인한 다음 0.5 밀리리터 기본 용액을 추가하십시오. 2 분 동안 300g의 속도로 원심 분리기. 프톱서스트 서스펜션은 바닥 용액을 흡입하여 얻을 수 있다.
소분자 화학형 시약 염색. 플루오-4/AM 로딩 솔루션을 2 밀리몰러 플루오-4/AM, 20%ethyl127 및 1-1 대 2 비율로 10X 인산완충식염식염으로 준비한다. 플루오-4/AM의 마이크로리터 로딩 솔루션 1을 99 마이크로리터 프로토프스트 서스펜션에 추가합니다.
형광염료의 최종 농도는 5 마이크로몰라입니다. 용액을 섞은 다음 튜브를 닫습니다. 동시에, 란탄은 작은 분자 화학 형광제의 칼슘 또는 고유성을 철분합니다.
마이크로리터 1개 또는 10마이크로리터 더 랜타넘 아이언을 추가한 다음 플루오-4/AM의 마이크로리터 로딩 솔루션 1개를 98마이크로리터 프로토프라스트 서스펜션에 추가합니다. 라탄철의 최종 농도는 100 마이크로몰라입니다. 용액을 섞은 다음 튜브를 닫습니다.
어둠 속에서 30 분 동안 37도에서 배양하십시오. 그 후, 2 분 동안 300 G의 속도로 원심 분리기. 17 마이크로리터 용액에 흡인하고 17 마이크로리터 기본 솔루션을 추가합니다.
30분 동안 37도에서 프로토프스트 서스펜션을 30분 동안 배양하여 50마이크로리터 프토프러스트 서스펜션을 흡기하고 슬라이드에 떨어뜨립니다. 형광 현미경으로 관찰하십시오. 관찰할 배율과 GFP 채널을 20배 선택합니다.
밝기를 0.5로 균일하게 조정합니다. 이 제안된 방법의 중요한 단계는 프톱서스트에 있는 얼룩을 세척하고 30 분 동안 배양하는 것입니다. 세척이 부족하면 관찰 중에 형광에 과도한 후원자가 발생하며 잠복이 있어 더 나은 로딩이나 프로브를 세포질로 재적재할 수 있습니다.
Protoplasts 생존 분석 소요 99 마이크로 리터 protoplasts 30 분 동안 37도에서 배양 후. FD 솔루션에 1ml를 추가하여 프스토플라스트 서스펜션에 추가합니다. 용액을 여러 번 위아래로 피펫팅한 다음 튜브를 닫습니다.
어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 유지하십시오. 슬라이드를 준비하고 GFP 채널을 통해 형광 현미경으로 관찰하십시오. 우리는 당신에게 그림 하나 다음 결과를 제시한다.
우리는 펄프에서 프톱을 얻는 모든 효소 방법을 사용합니다. 일부 프톱라스에는 바쿠올이 있었고 다른 프로토폴은 그렇지 않았습니다. 프루프는 5분 동안 FD로 염색되었고, 고온, 37도가 생존율 또는 전도도 2에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내는 세포질의 플로레스센트를 보여 준다.
프톱서스트는 칼슘 철형 광등 표시기 중 하나에서 형광을 나타내지 않았거나 그 안에 적재되지 않았습니다. 플루오-4/AM보다 프루프라스트에 적재되었지만, 백석은 형광이 되었다. 칼슘 채널을 효과적으로 차단하는 란타눔 아이언은 세포막이 프로토프스트 플루오-4/AM 로딩에 첨가되었다.
100 마이크로몰라 라나탄 다리미의 최종 농도에서 칼슘 형광 강도를 현저히 감소시다. 이 결과는 플루오-4/AM이 세포석에서 칼슘 철에 효과적으로 머무르고 칼슘 철함량의 역동적인 변화를 보여준다는 것을 더욱 보여주었습니다. 도 3 부토-4/AM 결과는 IMH 승인을 사용하여 분석되었으며 6.0 소프트웨어 플루오-4/AM 염색을 사용하여 라탄 섬의 첨가로 세포질 칼슘 철의 플로레시션 값을 현저히 감소시키는 것으로 분석되었다.
이 비디오에서는 모든 전도가 효소 가수분해에 의해 얻어졌습니다. 우리는 성공적으로 37도에서 프톱서스트에 형광 프로브를로드. 더 이상, 방법은 전도의 생존에 영향을 미치지 않았다.
요약하자면, 여기에 설명된 메서드는 상세합니다. 사과 펄프 세포에서 세포질 칼슘 이온의 동적 변화는 칼슘 관련 연구의 추가 목적을 위해 10 동등한 지원을 제공한다.
