重要なミネラル要素として、カルシウムはリンゴなどの樹木果実の成長と品質管理において重要な役割を果たし、貯蔵中の硬度、糖度、貯蔵期間、および生理学的障害を調節することができます。カルシウムイメージングは、細胞質におけるカルシウムイオンの動的変化を検出する最も西洋的な方法です。Fluo-4/AMなどの低分子蛍光指標はカルシウムイオン特異的選択性を有し、フレキシブルで迅速で非細胞毒性のエステル化インキュベーションにより非侵襲的にロードすることができます。
このプロトコルは、植物プロトプラストに小分子化学蛍光試薬fluo-4/AMをロードする方法を導入する。プロトプラスト抽出 1.5 ミリリットル遠心分離チューブに 0.5 ミリリットルの酵素溶液を加えます。健康で熟したリンゴを選び、パルプを10倍の5倍の立方ミリメートルサイズにスライスします。
パルプピースを酵素溶液に入れ、チューブを閉じます。1時間28度でチューブをインキュベート。暗闇の中で70 rpmでシャック。
その後、パルプ部分を洗浄し、酵素溶液をすべて吸引し、0.5ミリリットルの塩基性溶液を加えます。2分間300gの速度で遠心分離機。プロトプラスト懸濁液は底液を吸引することにより得ることができる。
低分子化学蛍光試薬染色。fluo-4/AM負荷溶液を2ミリモルフルオ-4/AM、20%ethyl127、10Xリン酸緩衝生理食塩水を1~1~2の比率で調製します。99マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液にフルー4/AMの1マイクロリットルの負荷溶液を加えます。
蛍光色素の最終濃度は5マイクロモルです。溶液を混ぜてからチューブを閉じます。同時に、ランタンは、小分子化学蛍光剤のカルシウムまたは独自性を鉄。
1マイクロリットルまたは10マイクロリットル以上のランタン鉄を加え、フルオロ4/AMのマイクロリットル負荷溶液を98マイクロリットルのプロトプラストサスペンションに加えます。ランタン鉄の最終濃度は100マイクロモルである。溶液を混ぜてからチューブを閉じます。
暗い中で30分間37度でインキュベートします。その後、300Gの速度で2分間遠心分離する。17マイクロリットル溶液に吸気し、17マイクロリットルの基本的な溶液を加える。
その後30分間37度でプロトプラスト懸濁液をインキュベートし、50マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液を吸引し、スライドに滴下する。蛍光顕微鏡で観察します。20倍の倍率とGFPチャンネルを選択して観察します。
明るさを 0.5 に均一に調整します。この提案された方法の重要なステップは、プロトプラストの汚れを洗浄し、30分間インキュベートすることです。十分な洗浄は観察中に蛍光に過剰な後ろを引き起こし、インキュベーションはより良い負荷または細胞質へのプローブを可能にする。
プロトプラスト Viability アッセイ 37 度で 30 分間インキュベートした後、99 マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液を取ります。FD溶液に1mlを加えて、プロトプラスト懸濁液にします。溶液を数回上下にピペットして混ぜ、チューブを閉じます。
暗い中で5分間室温に滞在します。スライドを準備し、GFPチャネルで蛍光顕微鏡でそれらを観察します。私たちはあなたに結果を提示する図1に続きます。
パルプからプロトプラストを得る酵素的な方法を使用します。一部のプロトプラストは液胞を持っていましたが、他のプロトプラストは持っていませんでした。プロトプラストをFDで5分間染色し、細胞質の中の花を示し、高温、37度が生存率またはプロトプラスト図2に影響を与えないことを示す。
プロトプラストは、カルシウム鉄蛍光指標の1つに蛍光を示さなかったか、それらにロードされていない。fluo-4/AMよりも原虫に積み込まれたが、細胞は蛍光となった。カルシウムチャネルを効果的に遮断するランタン鉄は、細胞膜をプロトプラストフルオ-4/AM負荷に添加した。
100マイクロモルランタン鉄の最終濃度では、カルシウム蛍光強度を大幅に減少させます。この結果は、fluo-4/AMが効果的に細胞芽球のカルシウム鉄に留まり、カルシウム鉄含有量の動的変化を示していることをさらに実証した。図3 Fluo-4/AMの結果は、ランタン鉄を添加したIMH承認6.0ソフトウェアフルオ4/AM染色を用いて分析し、細胞質カルシウム鉄の蛍光値を有意に低下させた。
本ビデオでは、全てのプロトプラストを酵素加水分解により得た。蛍光プローブを37度でプロトプラストに積み込むことに成功しました。さらに、この方法はプロトプラストの生存率に影響を与えなかった。
要約すると、ここで説明する方法は種類の詳細です。リンゴ果肉細胞における細胞質カルシウムイオンの動的変化により、カルシウム関連研究のさらなる目的のために10等しい支持を提供する。
