En tant qu’élément minéral important, le calcium joue un rôle clé dans la croissance et le contrôle de la qualité des fruits des arbres tels que la pomme, il peut réguler la dureté, la teneur en sucre, la période de stockage et le désordre physiologique pendant le stockage. L’imagerie calcique est la méthode la plus occidentale pour détecter les changements dynamiques dans les ions calcium dans le cytoplasme. Les indicateurs fluorescents à petites molécules, tels que fluo-4 / AM, ont une sélectivité spécifique aux ions calcium et peuvent être chargés de manière non invasive par incubation d’estérification, qui est flexible, rapide et non cytotoxique.
Ce protocole introduira une méthode de chargement de petites molécules de réactif fluorescent chimique fluo-4/AM dans des protoplastes végétaux. Extraction de protoplaste Ajouter 0,5 millilitre de solution enzymatique dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Choisissez une pomme saine et mûre, puis coupez la pulpe en 10 fois 5 fois 1 millilitre cube.
Placez les morceaux de pâte dans une solution enzymatique, puis fermez le tube. Incubé le tube à 28 degrés pendant une heure. Enchaîné à 70 tr/min dans l’obscurité.
Après cela, lavez les morceaux de pulpe, aspirez toute la solution enzymatique, puis ajoutez une solution de base de 0,5 millilitre. Centrifuger à une vitesse de 300 g pendant 2 minutes. La suspension de protoplastes peut être obtenue en aspirant la solution inférieure.
Coloration du réactif de fluorescence chimique à petites molécules. Préparer la solution de chargement fluo-4/AM avec un fluo-4/AM de 2 millimolaires, 20% d’éthyl127, et la solution saline tamponnée au phosphate 10X dans un rapport de un à un à deux. Ajouter 1 solution de charge de microlitres de fluo-4/AM à 99 microlitres de suspension de protoplaste.
La concentration finale de colorants fluorescents est de 5 micromolaires. Mélanger la solution puis fermer le tube. Dans le même temps, le fer lanthane est le calcium ou l’unicité du petit agent fluorescent chimique moléculaire.
Ajouter un microlitre ou 10 microlitres de fer lanthane de plus, puis une solution de charge de microlitre de fluo-4/AM à 98 microlitres de suspension de protoplastes. La concentration finale de fer lanthane est de 100 micromolaires. Mélanger la solution puis fermer le tube.
Incuber à 37 degrés pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après cela, centrifugez à la vitesse de 300 G pendant deux minutes. Aspirer à 17 microlitres et ajouter une solution de base de 17 microlitres.
Incuber la suspension de protoplaste à 37 degrés pendant 30 minutes pour complètement Après cela, aspirer 50 microlitres de suspension de protoplastes et goutter sur une glissière. Observez au microscope à fluorescence. Sélectionnez le grossissement 20x et le canal GFP à observer.
Réglez uniformément la luminosité à 0,5. Une étape critique de cette méthode proposée consiste à laver la tache dans les protoplastes et à les incuber pendant 30 minutes. Un lavage insuffisant provoque un soutien excessif sur la fluorescence pendant l’observation et l’incubation permet une meilleure charge ou la sonde dans le cytoplasme.
Test de viabilité des protoplastes Prendre 99 microlitres de suspension de protoplastes après une incubation à 37 degrés pendant 30 minutes. Ajouter 1 ml au niveau de la solution FD à la suspension de protoplastes. Mélanger la solution en pipetant de haut en bas plusieurs fois, puis fermer le tube.
Restez à température ambiante pendant cinq minutes dans l’obscurité. Préparez les lames et observez-les au microscope à fluorescence avec canal GFP. Nous vous présentons les résultats Suivant la première figure.
Nous utilisons la méthode enzymatique pour obtenir des protoplastes de la pulpe. Certains protoplastes avaient une vacuole alors que d’autres n’en avaient pas. Les protoplastes ont été colorés avec FD pendant cinq minutes et montrent le florescent dans le cytoplasme indiquant qu’une température élevée, 37 degrés n’affecte pas la viabilité ou les protoplastes Figure deux.
Les protoplastes n’ont montré aucune fluorescence dans l’un des indicateurs de fluorescence des fers à calcium ou il n’est pas chargé dans eux. Que dans fluo-4 / AM a été chargé dans le protoplaste, le cytoplaste, mais pas une vacuole est devenu fluorescent. Lanthane Les fers qui bloquent efficacement les canaux calciques sont la membrane cellulaire ont été ajoutés à la charge Protoplast fluo-4 / AM.
À la concentration finale de 100 fers de lanthane micromolaires, ils réduisent considérablement l’intensité de la fluorescence du calcium. Ces résultats ont en outre démontré que le fluo-4 / AM reste efficacement dans les fers de calcium dans le cytoplaste et qu’il montre des changements dynamiques dans la teneur en fers de calcium. Figure trois Les résultats fluo-4/AM ont été analysés à l’aide de la coloration fluo-4/AM approuvée par le logiciel IMH plus 6.0 avec ajout de fers lanthanes réduisant considérablement la valeur de floraison des fers calciques cytoplasmiques.
Dans cette vidéo, tous les protoplastes ont été obtenus par hydrolyse enzymatique. Nous avons chargé avec succès les sondes fluorescentes dans un protoplaste à 37 degrés. De plus, la méthode n’a pas affecté la viabilité des protoplastes.
En résumé, la méthode décrite ici en nature détaillée. Les changements dynamiques dans les ions calcium cytoplasmiques dans les cellules de la pulpe de pomme fournissant ainsi 10 supports égaux pour les objectifs ultérieurs des études liées au calcium.
