Como elemento mineral importante, el calcio juega un papel clave en el crecimiento y el control de calidad de los frutos de los árboles como la manzana, puede regular la dureza, el contenido de azúcar, el período de almacenamiento y el trastorno fisiológico durante el almacenamiento. Las imágenes de calcio son el método más occidental para detectar cambios dinámicos en los iones de calcio en el citoplasma. Los indicadores fluorescentes de moléculas pequeñas, como fluo-4 / AM tienen selectividad específica de iones de calcio y pueden cargarse de forma no invasiva mediante incubación de esterificación, que es flexible, rápida y no citotóxica.
Este protocolo introducirá un método para cargar el reactivo fluorescente químico de molécula pequeña fluo-4 / AM en protoplastos de plantas. Extracción de protoplastos Agregue 0.5 mililitros de solución enzimática en un tubo centrífugo de 1.5 mililitros. Elija una manzana sana y madura, luego corte la pulpa en 10 veces 5 veces 1 mililitro cúbico de tamaño.
Coloque las piezas de pulpa en una solución enzimática, luego cierre el tubo. Incubar el tubo a 28 grados durante una hora. Encadenado a 70 rpm en la oscuridad.
Después de eso, lave las piezas de pulpa, aspire toda la solución enzimática y luego agregue la solución básica de 0.5 mililitros. Centrifugar a una velocidad de 300 g durante 2 minutos. La suspensión de protoplastos se puede obtener aspirando la solución inferior.
Tinción de reactivos de fluorescencia química de moléculas pequeñas. Prepare la solución de carga fluo-4/AM con un fluo-4/AM de 2 milimolares, 20% de etilo127 y la solución salina tamponada con fosfato 10X en una proporción de uno a uno a dos. Añadir 1 solución de carga de microlitros de fluo-4/AM a la suspensión de protoplastos de 99 microlitros.
La concentración final de colorantes fluorescentes es de 5 micromolares. Mezcle la solución y luego cierre el tubo. Al mismo tiempo, el lantano plancha el calcio o singularidad del pequeño agente químico molecular fluorescente.
Agregue un microlitro o 10 microlitros más de hierro lantano y luego una solución de carga de microlitros de fluo-4 / AM a la suspensión de protoplastos de 98 microlitros. La concentración final de hierro lantano es de 100 micromolares. Mezcle la solución y luego cierre el tubo.
Incubar a 37 grados durante 30 minutos en la oscuridad. Después de eso, centrífuga a la velocidad de 300 G durante dos minutos. Aspire a la solución de 17 microlitros y agregue una solución básica de 17 microlitros.
Incubar la suspensión de protoplastos a 37 grados durante 30 minutos para completar completamente Después de eso, aspirar 50 microlitros de suspensión de protoplastos y gotear sobre un portaobjetos. Observar bajo microscopio de fluorescencia. Seleccione el aumento de 20 veces y el canal GFP para observar.
Ajuste uniformemente el brillo a 0.5. Un paso crítico en este método propuesto es lavar la mancha en los protoplastos e incubarlos durante 30 minutos. El lavado insuficiente causa un respaldo excesivo en la fluorescencia durante la observación y la incubación permite una mejor carga o la sonda en el citoplasma.
Ensayo de viabilidad de los protoplastos Tome 99 microlitros de suspensión de protoplastos después de incubar a 37 grados durante 30 minutos. Añadir 1 ml en la solución FD a la suspensión de protoplastos. Mezcle la solución mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces y luego cierre el tubo.
Permanezca a temperatura ambiente durante cinco minutos en la oscuridad. Prepare las diapositivas y obsérnese en el microscopio de fluorescencia con canal GFP. Te presentamos los resultados Siguiendo la figura uno.
Utilizamos el método enzimático para obtener protoplastos a partir de la pulpa. Algunos protoplastos tenían una vacuola, mientras que otros no. Los protoplastos se tiñeron con FD durante cinco minutos y muestran la florescente en el citoplasma indicando que la alta temperatura, 37 grados no afecta a la viabilidad o protoplastos Figura dos.
Los protoplastos no exhibieron fluorescencia en uno de los indicadores de fluorescencia de los hierros de calcio o no está cargado en ellos. Que en fluo-4/AM se cargó en el protoplasto, el ciplasto, pero no una vacuola se volvió fluorescente. Los hierros de lantano que bloquean eficazmente los canales de calcio son la membrana celular se agregaron a la carga de Protoplast fluo-4 / AM.
A la concentración final de 100 hierros lantanos micromolares reducen significativamente la intensidad de la fluorescencia del calcio. Estos resultados demostraron además que la fluo-4 / AM se mantiene efectivamente en los hierros de calcio en el ciplasto y muestra cambios dinámicos en el contenido de hierros de calcio. Figura tres Los resultados de fluo-4/AM se analizaron utilizando la tinción fluo-4/AM aprobada por IMH más el software 6.0 con adición de hierros lantanos redujo significativamente el valor de florescencia de los hierros de calcio citoplasmáticos.
En este video, todos los protoplastos se obtuvieron por hidrólisis enzimática. Cargamos con éxito las sondas fluorescentes en un protoplasto a 37 grados. Más aún, el método no afectó la viabilidad de los protoplastos.
En resumen, el método descrito aquí en especie detallado. Los cambios dinámicos en los iones de calcio citoplasmáticos en las células de la pulpa de manzana proporcionan así 10 soportes iguales para el propósito adicional de los estudios relacionados con el calcio.
