המטרה הכוללת של ההליך שאנו מפרטים כאן היא לנתח מעורבות של סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטית. ציטוטים ראשוניים הוכחו חיוניים עבור צעדים רבים של התפתחות ניאוקורטית, כולל הרחבת תאי אב, קביעת גורל, כמו גם הגירה עצבית והתבגרות. כדי לנתח עוד יותר את מעורבות התא במהלך ההתפתחות הניאוקורטית, הקמנו כלים רלוונטיים על ידי ניצול מודלים מבוססי תאים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של iPS של התפתחות ניאו-קורטית.
במילים אחרות, רוזטות עצביות ואורגנוידים קדמיים גביים. מודלים תלת-ממדיים מבוססי תאי iPS מתחילים בהיווצרות גוף עוברי. הידבקות של גופים עובריים אמר, לאפשר דור של מבני רוזטה עצבית 2D, בעוד תרבות צף חופשי של EBs כאלה לאפשר דור של organoids המוח הקדמי הגב.
הפרוטוקול שהקמנו כדי ליצור organoids מוחי מבוסס על פרוטוקולים שפורסמו בעבר באמצעות שיטת הקאה על ידי הוספת גורמים טרום דפוס כדי ליצור במיוחד organoids המוח הקדמי הגב באמצעות מעכבים של nodal activin מסלול BMP, הידוע גם בשם עיכוב SMAD כפול. כדי לנצל את הארגון התלת-ממדי של האורגנוידים, הקמנו שיטה פשוטה ומהירה, המאפשרת חיסון מוחלט, סליקה ורכישה מוארת של האורגנויד כולו ברזולוציה גבוהה. וכדי להתמקד בביוגנזה ופונקציות עיקריות של סיליום, התאמנו אימונוהיסטוכימיה על קטעים צפים חופשיים שנחתכו עם רטט.
לאחר חיסון וניקוי של החלקים, רכשנו את התמונות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקת תהודה. התחל עם תרביות תאים iPS מחסה מושבות רגילות גדולות, להפגין פחות מ 10% בידול והם לא יותר מ 80% תואם. לנתח באופן ידני כל מושבת תאי IPS באמצעות מחט, ומאפשר לתפוס בדיוק כל מושבה בכיוונים אופקיים ואנכיים כדי ליצור תבנית לוח דמקה, חלוקת כל מושבה לאשכולות שווים.
נתק את המושבה באמצעות מגרד תאים והעבר אותם ללוח תרבות קובץ מצורף נמוך במיוחד. תן להם לצוף בן לילה באינקובטור כדי שיוכלו ליצור גופים עובריים. למחרת, להפוך את המדיום, הקפדה לא לשאוף את הגופים העובריים, ולהעביר אותם לתוך מנות פולי-L-ornithine למינין מצופה עד היווצרות של רוזטות עצביות.
זה לוקח בערך 12 עד 14 ימים. אינדוקציה מרעננת יומית, בינונית, ובדיקה תחת מיקרוסקופ להיווצרות של מבני רוזטה עצביים. בשלב זה, רוזטות עצביות ניתן להרחיב, להבדיל, ולעבד לניתוח חיסוני או מנותק כדי לקבל גזע עצבי מבודד תרביות תאים מולדים.
קודם כל, התחילו עם תרבויות IPS מחסה מושבות רגילות גדולות המציגות פחות מ -10% בידול ואשר עברו כמעט פעם אחת על monolayer. ביום אפס, לאפשר לתא IPS ליצור גופים עובריים במדיום EB המכיל ריכוז נמוך של fJ2 וריכוז גבוה של מעכבי ROCK הנדרש להישרדות תאי hiiPS כדי למנוע צלחות אינקובטור היווצרות EB מטריד במשך שלושה ימים ללא שינוי בינוני. ביום השלישי, EBs צריך למדוד כ 400 מיקרומטר ולהראות גבולות קבועים.
אם קריטריונים קודמים עשירים עבור רוב EBs, לשנות את המדיום עם מדיום אינדוקציה אחד המכיל מעכבי SMAD כפול בהחלט כדי להאיר את DBs קונטרה על ידי הטוב ביותר שש עד שבע, המציין ויתור עצבי tomaly. והם הופכים DBs אחרים למדדי ממברנת מרתף מופחתת ברוטו. משלב זה תמיד להשתמש במספריים סטריליות כדי לקבל את הפתיחה של פפטידים כדי למנוע נזק של organoids.
העברה ראשונה על 15 organoids לצינור קליני. תן ל- EB להתיישב ולהסיר את המדיום ב 50 מיקרוליטרים של אינדוקציה בינונית שתיים ולהעביר את האורגנוידים לצינור מיקרו-רגיש המכיל 100 מיקרוליטרים של מטריצה והומוגניים על ידי צנרת למעלה ולמטה. מורחים את התערובת על מרכז באר של צלחת התקשרות נייטרלית.
ולבסוף, EBs חלל כך שהם לא לגעת אחד בשני כדי למנוע מהם להתיך. תן את העניין להתמצק באינקובטור במשך 45 דקות, להוסיף אינדוקציה בינונית שתיים לכל באר ולדגור באינקובטור. רענן אינדוקציה בינונית שתיים כל יומיים.
ביום 17, לנתק את מטריצת קרום המרתף באופן ידני על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים עם חמש פיפטות מיליליטר. דגירה צלחת organoid במדיום התרגום אחד תחת תסיסה כדי לשפר את הספיגה התזונתית. חשוב לציין, השתמש בחממה שונה לתרבות נייחת ותרבות נייחת בשייקר מסלולית כדי למנוע תנודות מזיקות לצמיחת תאי IPS דבקים.
לאחר קיבעון, חלחול, חסימה ודגרה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים לוקח 10 ימים, כולל צעדי כביסה. שיטת הסליקה המועדפת עלינו מסתמכת על TDE, נגזרת גליקול. עבור ניקוי אופטימלי, לצנרר את organoid בתמיסת TDE עם ריכוז מוגבר בהדרגה במשך 24 שעות כל אחד.
להטמעת אורגנויד, השתמשו במערכת דפוס ראשית מותאמת אישית העשויה מהמזרק המ"ל האחד, אשר קצהו נחתך באמצעות אזמל. נקודת התכה נמוכה אגרוז מומלץ, כמו טמפרטורת ההיתוך שלה היא רק כ 60 מעלות צלזיוס. הכן 4% אגרוז נמס נמוך בתמיסה של 60% TDE ותן לו להתקרר רק על 37 מעלות צלזיוס בבסיס מים טרום אורגנויד הטבעה.
שים את המזרק 600 microliters של פתרון הג'ל באמצעות הבוכנה, ולאחר מכן למקם את המדגם ולמלא את המזרק עם 400 microliters של פתרון ג'ל. תן את הג'ל פולימריזציה, ולבסוף, המדגם מותקן באופן אידיאלי בתוך הג'ל והוא יכול להידחף בקלות החוצה בתוך החדר המואר כדי למקם את organoid מול המטרה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוארת אידיאלית להדמיה ראשונה של אורגנויד ברור כזה.
צמצמנו את הדמיית התמונות ושקלנו רזולוציה תת-תאית. כאן, השתמשנו במטרה של פי 20 בפתרון 80% TDE שנוסף בתא הדגימה כדי לאפשר להתאים במדויק לאינדקס השבירה של שיטת הסליקה שלנו. סדר הדגימה הגדול ביותר תוכנן להכיל מזרק של מיליליטר שניתן להכניס מלמעלה עם הבוכנה שניתן להפעיל ברגע שסדר המדגם מותקן כדי למקם את האורגנויד מול המטרה.
רכישת אורגנויד שלם לוקח בערך 5 עד 10 דקות. עבור כתמי אימונו על חלקים צפים חופשיים, לאסוף ולתקן את האורגנוידים שלך בחלק של ארבעה אנשים לילה בארבע מעלות צלזיוס. הטמע את האורגנוידים לתוך 4% אגרוז נמס נמוך וקטע באמצעות vibratome כדי להשיג 150 מיקרומטר של שישה חלקים שהועברו בתמיסת PBS, באמצעות מברשת צבע כדי למנוע נזק להם.
לאחר חדירות וחסימה, דגירה של החלקים הצפים החופשיים עם נוגדן ראשוני בן לילה בארבע מעלות צלזיוס ותחת תסיסה. לשטוף את החלקים בזהירות לפני הדגירה עם נוגדן משני במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ותחת תסיסה. לבסוף, עבור סליקה אופטימלית, לדגור על החלק בתמיסת TDE עם ריכוז מוגבר בהדרגה במשך שעה אחת ו 30 ב 60% TDE ולאחר מכן ב 80% TDE לילה בטמפרטורת החדר.
אחסן את המקטע בפתרון TDE ו- TLAC של 80%TDE ו- TLAC בארבע מעלות צלזיוס. הר מקטע צף חופשי בתא תאים, תוך מאמץ לשמור על המדגם בתמיסת 80% TDE ותוכנן להסתגל לשלב ממונע של מיקרוסקופים קליניים. ראשית, לשים להחליק כיסוי עגול אחד בתא ולהעביר בזהירות את ההגנה ברורה באמצעות מברשת צבע.
מלא את התא בתמיסת 80% TDE ולאחר מכן הוסף שני פתקי כיסוי סטנדרטיים בתוספת תלוש כיסוי עגול שני וחותמת סיליקון. לבסוף, בורג על טבעת ההברגה של התא כדי לאטום באופן מושלם את המערכת. גליון לילה, כמו גם רכישות תהודה מעובדים הודות לתוכנה המאפשרת ניצול תלת-ממדי וניתוח של מדגם החיסון כולו.
תוכנה כזו מאפשרת לך לפתוח במהירות נתונים עצומים שאנו מייצרים כדי ליצור תמונות ואנימציות בקלות. זה אפשר להזיז את המדגם בכיוון שונה ואנחנו יכולים ליצור תצוגות דו-ממדיות של התמונה הודות לכלי פריסה דו-ממדי בכיוון שונה, X, Y ו- Y, Zed, למשל. בנוסף, תוכנה כזו מאפשרת זיהוי אוטומטי של ריסונים מרכזיים וראשוניים כאחד, ומאפשרת לכמת את המספר בתנאי בקרה פתולוגיים לעומת שליטה.
זה גם מאפשר שחזור 3D של cilia ראשי למדידה מדויקת של האתרים. הפרוטוקול שתיארנו עבור מודלים דו-ממדיים מבוססי תאי iPS של התפתחות קליפת המוח החדשה מאפשר דור של מבני רוזטה עצביים המכילים אבות קליפת המוח החדשים ותאי עצב דומים לאלה שנראו בניאוקורטקס המתפתח. אימות מפורט יכול להתבצע על ידי ניתוח חיסוני קונבנציונלי.
אבות ישימים צריכים להיות מוכתמים פעמיים איתנו כדי להשפיע על רגישויות בעוד אבות ביניים מתגלים על ידי כתמי TBI2 נוירונים ניאוקורטיים עצם מוקדם על ידי כתמים חיוביים CTIP2. מבנים דמויי רוזט עצביים כאלה מדגימים הגירה גרעינית בין-קינטית של אבות רדיקליים שניתן לדמיין על ידי חיסון עם נוגדנים שהועלו נגד וימנטין פוספו שמכתימים גרעינים מוטוטיים ו- TBX2 המקיים את הציר המיטוטי. לבסוף, ciliagenesis ניתן לנתח על ידי חיסון עם נוגדנים הרים נגד קרום המוח, כי מכתים את הגוף האחורי של cilia העיקרי והם באמצעים מסוימים כי כתמים האקסיומה.
על מבנה רוזט כזה, ריסים ראשוניים שחולצו מן האבות הקדמונים פולי פברי-קאל apical ובצפיפות מעל לומן המרכזי של כל אזור פיתום בזמן שהם בולטים גם נוירונים חיוביים CTIP2. דיסוציאציה של רוזטות אדנונורליות מאפשרת ליצור גזע עצבי מבודד ותרבויות תאים אבהיים כי הם מאוד שימושיים כדי לנתח ביוגנזה ותפקוד cilium ראשוני. בפרט, אנו מפרטים את ההליך כדי לבדוק את האינדוקציה של מסלול התרופה הקולית לאחר הטיפול עם תרופה קולית מומלצת או אגוניסטים אוסמוסין.
לאחר מכן RTPCR SA בודק את האינדוקציה של גנים יעד תרופה סוניקה, כגון GLI1 ו PTCH1, וניתוח immunofluorescence בודק את הדינמיקה של רכיבי תרופה קולית מפתח לאורך הסיליום העיקרי כי לקבל כימות, הודות לכלי קוד פתוח, ilastik ו CiliaQ. פרמטרים ciliary שונים, כולל אורך והתמצאות, נחקרים אבל גם אינטנסיביות של רכיבי cilium העיקרי מוצגים כאן עבור GLI2 ו- GPR161 כי, בהתאמה, accumuulate או לצאת מן cilium הראשי בתגובה לטיפול תרופתי סוניקה מומלץ. הפרוטוקול שאנו מפרטים עבור 3D iPS מבוססי תאים מודלים של התפתחות ניאוקורטית מאפשר דור של organoid מוחי הומוגני עם זהות המוח הקדמי הגבית שיכול להיות מאופיין או על ידי ניתוח חיסוני קונבנציונאלי או על ידי הכתמת אישה, כפי שמוצג כאן, עם חדירה אופטימלית של הנוגדנים שהועלו, שוב, N-cadherin, PAX6, ו CTIP2 כי כתם קדרין עצבי בהתאמה, בוורוד, אבות אפיים באזור החדר כמו אזור, בירוק, וכל הנוירונים הניאוקורטיים שזה עתה נולדו, הממוקמים בצלחת קליפת המוח כמו אזור.
הנה סרט שני של כל האורגנויד החיסוני עם נוגדנים שגדלו שוב, CTIP2, באדום, אולי לשמור בוורוד, ו TPX2, בירוק, המאפשר לבדוק כמה מאפיינים של אבות ניאוקורטיים, כגון, הגירה גרעינית interkinetic של אבות פברי-קאל. מעניין, זרחן vimentin אבות חיוביים נצפים גם באזור supraventricular כמו אזור ולהכיל תהליך חיובי ייחודי המשתרע על פני השטח החיוביים, מזכיר אבות גליה רדיאלי חיצוני וממחיש את הרזולוציה הגבוהה של שיטה זו. הנה סרט של קטע חיסוני, צף חופשי, שנרכש הודות למיקרוסקופ סריקת תהודה המציג ריסים ראשוניים שזוהו בנוגדן פריקנטרין המוכתם בחלק האחורי של הגוף, בירוק, ונוגדני ARLT3B שמכתימים את האקסיומה, בוורוד.
הריסים העיקריים משתרעים מכל תאי הגבעול והאב העצבי, בפרט, על פני השטח האפוסיים של האבות האפיקליים, אך גם בתאי העצב הניאוקורטיים של האזור דמוי הלוח. לבסוף רוזטות נוירון 2D ותאי גזע ואבות מבודדים recapitulate מספר היבטים של התפתחות קליפת המוח ולייצג כלים משלימים, שימושיים כדי לבדוק biogenesis ciliary ותפקוד. הפרוטוקול שאנו מזהים כאן אפשר לנו ליצור בהצלחה אורגנוידים קדמיים גביים מקווי תא IPS ברורים אלה המביאים לתוצאות הומוגניות, ומבטיחים את החוסן של הליך זה.
הפרוטוקולים שהקמנו לחיסון, סליקה והדמיה של אורגנוידים שלמים או מקטעים צפים חופשיים הם פשוטים, מהירים וחסכוניים. שילוב מודלים מבוססי תאים כאלה וניתוח הדמיה תלת-ממדית בתאי iPS, הנוצרים על ידי תכנות מחדש של תאי הפרעה ciliary או באמצעות טכנולוגיית CRISPR 9 לעריכה ספציפית של גנים ciliary, אמור לאפשר התקדמות משמעותית בהבנת תרומתו של הסיליום העיקרי במהלך התפתחות נורמלית ופתולוגית של קליפת המוח.
