L'obiettivo generale della procedura che descriviamo qui è quello di sezionare il coinvolgimento del cilio primario durante lo sviluppo neocorticale. Le ciglia primarie si sono dimostrate cruciali per molte fasi dello sviluppo neocorticale, tra cui l'espansione delle cellule progenitrici, la determinazione del destino, nonché la migrazione e la maturazione neuronale. Per sezionare ulteriormente il coinvolgimento cellulare durante lo sviluppo neocorticale, abbiamo impostato strumenti pertinenti sfruttando i modelli emergenti basati su cellule iPS 2D e 3D dello sviluppo neocorticale.
In altre parole, rosette neurali e organoidi del proencefalo dorsale. I modelli 3D basati su cellule iPS iniziano con la formazione del corpo embrioide. L'adesione di detti corpi embrioidi, consente la generazione di strutture neurali a rosetta 2D, mentre la coltura fluttuante di tali EB consente la generazione di organoidi del proencefalo dorsale.
Il protocollo che abbiamo impostato per generare organoidi cerebrali si basa su precedenti protocolli pubblicati utilizzando il metodo del bavaglio aggiungendo fattori di pre-patterning per generare specificamente organoidi del proencefalo dorsale utilizzando inibitori della via l'activina nodale e BMP, nota anche come doppia inibizione SMAD. Per sfruttare l'organizzazione 3D degli organoidi, abbiamo impostato un metodo semplice e veloce, che consente in totale immunolabeling, clearing e acquisizione illuminata dell'intero organoide ad alta risoluzione. E per concentrarci sulla biogenesi e le funzioni del cilio primario, abbiamo adattato l'immunoistochimica su sezioni fluttuanti tagliate con un vibratoma.
Dopo l'immunocolorazione e la pulizia delle sezioni, abbiamo acquisito le immagini utilizzando la microscopia confocale a scansione risonante. Inizia con colture cellulari iPS che ospitano grandi colonie regolari, che mostrano una differenziazione inferiore al 10% e non sono conformi all'80%. Seziona manualmente ogni colonia di cellule iPS usando un ago, permettendo di catturare con precisione ogni colonia in direzioni orizzontali e verticali per creare un modello a scacchiera, dividendo ogni colonia in gruppi uguali.
Staccare la colonia usando un scrapper cellulare e trasferirli su una piastra di coltura ad attacco ultra basso. Lasciateli galleggiare durante la notte nell'incubatrice in modo che possano formare corpi embrioidi. Il giorno dopo, gira il mezzo, facendo attenzione a non aspirare i corpi embrioidi e trasferiscili in piatti rivestiti di poli-L-ornitina laminina fino alla formazione di rosette neurali.
Ciò richiede circa 12-14 giorni. Induzione di aggiornamento giornaliero, mezzo e controllo al microscopio per la formazione di strutture neurali rosette. Da questa fase, le rosette neurali possono essere espanse, differenziate ed elaborate per l'analisi immunocolorante o dissociate per ottenere colture isolate di staminali neurali e cellule progenitali.
Prima di tutto, inizia con le colture iPS che ospitano grandi colonie regolari che mostrano una differenziazione inferiore al 10% e che sono state passate quasi una volta sul monostrato. Al giorno zero, consentire alle cellule iPS di formare corpi embrioidi in mezzo EB contenenti una bassa concentrazione di fJ2 e un'alta concentrazione di inibitore ROCK necessaria per la sopravvivenza delle cellule hiiPS per evitare di disturbare le piastre dell'incubatrice di formazione EB per tre giorni senza cambiamenti medi. Il terzo giorno, gli EB dovrebbero misurare circa 400 micrometri e mostrare confini regolari.
Se i criteri passati sono ricchi per la maggior parte degli EB, cambiare il mezzo con il mezzo di induzione uno contenente doppi inibitori SMAD certamente per illuminare i DB contra da sei a sette, indicando una concessione di tomaly neurale. E trasformano altri DB in metriche della membrana basale ridotta a fattore lordo. Da questo passaggio utilizzare sempre forbici sterili per ottenere l'apertura dei peptidi per evitare di danneggiare gli organoidi.
Primo trasferimento di circa 15 organoidi in un tubo clinico. Lasciare che l'EB si depositi e rimuova il mezzo a 50 microlitri di mezzo di induzione due e trasferire gli organoidi in un tubo microsensibile contenente 100 microlitri di matrice e omogeneizzati mediante pipettaggio su e giù. Distribuire la miscela sul centro di un pozzetto di una piastra di attacco neutra.
E infine, gli EB spaziali in modo che non si tocchino l'un l'altro per evitare che si fondano. Lasciare che la materia si solidifichi nell'incubatore per 45 minuti, aggiungere il mezzo di induzione due a ciascun pozzetto e incubare nell'incubatore. Aggiorna l'induzione media due a giorni alterni.
Il giorno 17, dissociare manualmente la matrice della membrana basale pipettando su e giù 10 volte con pipette da cinque ml. Incubare la piastra organoide nel mezzo di traduzione uno sotto agitazione per migliorare l'assorbimento nutrizionale. È importante sottolineare che utilizzare un incubatore diverso per la coltura stazionaria e la coltura su shaker orbitale per evitare vibrazioni dannose per la crescita delle cellule iPS aderenti.
Dopo la fissazione, la permeabilizzazione, il blocco e l'incubazione con anticorpi primari e secondari richiede 10 giorni, comprese le fasi di lavaggio. Il metodo di compensazione che abbiamo preferito si basa sul TDE, un derivato del glicole. Per una pulizia ottimale, intubare l'organoide in soluzione di TDE con concentrazione gradualmente aumentata per 24 ore ciascuno.
Per l'incorporamento di organoidi, utilizzare un sistema di stampaggio principale personalizzato ricavato dalla siringa da un ml, la cui punta viene tagliata usando un bisturi. Si raccomanda un basso punto di fusione L'agarosio, poiché la sua temperatura di fusione è di soli 60 gradi Celsius circa. Preparare l'agarosio a bassa fusione al 4% in soluzione di TDE al 60% e lasciarlo raffreddare a circa 37 gradi Celsius in un incorporamento pre-organoide a base d'acqua.
Inserire nella siringa 600 microlitri della soluzione gel utilizzando lo stantuffo, quindi posizionare il campione e riempire la siringa con 400 microlitri della soluzione gel. Lascia che il gel polimerizzi e, infine, il campione è montato idealmente all'interno del gel e può essere facilmente spinto fuori all'interno della camera illuminata per posizionare l'organoide davanti all'obiettivo. La microscopia a fluorescenza illuminata è ideale per la prima imaging di tali organoidi chiari.
Abbiamo ridotto l'imaging fotografico e pesato la risoluzione subcellulare. Qui, abbiamo utilizzato un obiettivo 20x immerso in una soluzione TDE all'80% aggiunta nella camera del campione per consentire di adattarsi con precisione all'indice di rifrazione del nostro metodo di compensazione. L'ordine di campione più grande è stato progettato per ospitare una siringa da un millilitro che può essere inserita dall'alto con lo stantuffo che può essere azionato una volta montato l'ordine del campione per posizionare l'organoide davanti all'obiettivo.
L'acquisizione di un intero organoide richiede circa 5-10 minuti. Per la colorazione immuno su sezioni fluttuanti, raccogli e fissa i tuoi organoidi in una parte di quattro persone durante la notte a quattro gradi Celsius. Incorporare gli organoidi in Agarosio a bassa fusione al 4% e sezione utilizzando un vibratoma per ottenere 150 micrometri di sei sezioni trasferite in soluzione PBS, utilizzando un pennello per evitare di danneggiarle.
Dopo la permeabilizzazione e il blocco, incubare le sezioni fluttuanti con anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius e sotto agitazione. Lavare accuratamente le sezioni prima dell'incubazione con anticorpi secondari per due ore a temperatura ambiente e sotto agitazione. Infine, per una pulizia ottimale, incubare la sezione in soluzione di TDE con concentrazione gradualmente aumentata per un'ora e 30 in 60% di TDE e poi in 80% di TDE durante la notte a temperatura ambiente.
Conservare la sezione in soluzione 80%TDE e TLAC a quattro gradi Celsius. Montare la sezione flottante in una camera cellulare, cercando di mantenere il campione in soluzione TDE all'80% e progettato per adattarsi a uno stadio motorizzato di microscopi clinici. Per prima cosa, metti un coperchio rotondo nella camera e trasferisci con attenzione la protezione trasparente usando un pennello.
Riempire la camera con una soluzione 80% TDE e quindi aggiungere due slip di copertura standard più un secondo coperchio rotondo e un sigillo in silicone. Infine, avvitare l'anello di avvitamento della camera per sigillare perfettamente il sistema. Nightsheet, così come le acquisizioni di risonanza vengono elaborate grazie a un software che consente l'utilizzo 3D e l'analisi dell'intero campione di immunostain.
Tale software consente di aprire rapidamente enormi dati che generiamo per creare facilmente istantanee e animazioni. Ha permesso di spostare il campione in diversi orientamenti e possiamo generare viste 2D dell'immagine grazie a uno strumento di affettatura 2D in diverso orientamento, X, Y e Y, Zed, per esempio. Inoltre, tale software consente il rilevamento automatico sia del centrosoma che delle ciglia primarie, consentendo di quantificare il numero in condizioni patologiche rispetto a quelle di controllo.
Consente inoltre la ricostituzione 3D delle ciglia primarie per la misurazione precisa dei siti. Il protocollo che abbiamo descritto per la modellazione 2D basata su cellule iPS di nuovo sviluppo corticale consente la generazione di strutture di rosette neurali che contengono nuovi progenitori corticali e neuroni simili a quelli osservati nella neocorteccia in via di sviluppo. La convalida dettagliata può essere eseguita mediante analisi immunocolorante convenzionale.
I progenitori applicabili dovrebbero essere doppiamente colorati con noi per la sensibilità all'impatto, mentre i progenitori intermedi sono rivelati dalla colorazione TBI2 e dai neuroni neocorticali ossei precoci dalla colorazione positiva CTIP2. Tali strutture neurali simili a rosette modellano la migrazione nucleare intercinetica di progenitori radicali che possono essere visualizzati mediante immunocolorazione con anticorpi sollevati contro la fosfo vimentina che macchiano i nuclei mototici e TBX2 che sostiene il fuso mitotico. Infine, la ciliagenesi può essere analizzata mediante immunocolorazione con anticorpi sollevati contro il pericentrico, che macchia il corpo posteriore delle ciglia primarie e sono di certi mezzi che macchiano l'assioma.
Su tale struttura a rosetta, le ciglia primarie estratte dai progenitori apicali poly Fabri-Kal e densamente sopra il lume centrale di ciascuna regione ventricolitica mentre sporgono anche dai neuroni CTIP2-positivi. La dissociazione delle rosette adenoneurali consente di generare colture isolate di staminali neurali e cellule progenitrici che sono molto utili per analizzare la biogenesi e la funzione del cilio primario. In particolare, descriviamo in dettaglio la procedura per testare l'induzione della via del farmaco sonico dopo il trattamento con farmaci sonici raccomandati o agonisti dell'osmosina.
Successivamente RTPCR SA testa l'induzione di geni bersaglio di farmaci sonica, come GLI1 e PTCH1, e l'analisi di immunofluorescenza testa la dinamica dei componenti chiave del farmaco sonico lungo il cilio primario che vengono quantificati, grazie a strumenti open source, ilastik e CiliaQ. Vengono studiati diversi parametri ciliari, tra cui lunghezza e orientamento, ma anche l'intensità dei componenti primari del cilio sono mostrati qui per GLI2 e GPR161 che, rispettivamente, si accumulano o escono dal cilio primario in risposta al trattamento farmacologico sonica raccomandato. Il protocollo che dettagliamo per la modellazione 3D basata su cellule iPS dello sviluppo neocorticale consente la generazione di organoidi cerebrali omogenei con identità del proencefalo dorsale che possono essere caratterizzati sia dall'analisi immunocolorante convenzionale che dalla colorazione della donna, come mostrato qui, con penetrazione ottimale degli anticorpi sollevati, di nuovo, N-caderina, PAX6 e CTIP2 che macchiano rispettivamente la caderina neuronale, in rosa, progenitori apicali nella zona ventricolare come regione, in verde, e tutti i neuroni neocorticali appena nati, situati nella regione simile alla piastra corticale.
Ecco un secondo filmato dell'intero organoide immunocolore con anticorpi rialzati, CTIP2, in rosso, possibilmente mantenere in rosa, e TPX2, in verde, permettendo di testare diverse caratteristiche dei progenitori neocorticali, come la migrazione nucleare intercinetica dei progenitori Fabri-Kal. È interessante notare che i progenitori positivi alla fosfo-vimentina sono anche osservati nella zona sopraventricolare come regione e ospitano un processo positivo unico che si estende alla superficie positiva, che ricorda i progenitori gliali radiali esterni e illustra l'alta risoluzione di questo metodo. Ecco un filmato di una sezione immunocolore, fluttuante, acquisita grazie a un microscopio a scansione di risonanza che mostra le ciglia primarie rilevate con anticorpo pericentrina che ha macchiato la parte posteriore del corpo, in verde, e anticorpi ARLT3B che macchiano l'assioma, in rosa.
Le ciglia primarie si estendono da tutte le cellule staminali e progenitrici neuronali, in particolare, sulla superficie epica dei progenitori epici ma anche nei neuroni neocorticali della regione simile alla piastra pre-piastra. Infine, rosette neuronali 2D e cellule staminali e progenitrici isolate ricapitolano diversi aspetti dello sviluppo corticale cerebrale e rappresentano strumenti complementari e utili per testare la biogenesi e la funzione ciliare. Il protocollo che qui rileviamo ci ha permesso di generare con successo organoidi del proencefalo dorsale da queste distinte linee cellulari iPS che danno origine a risultati omogenei, garantendo la robustezza di questa procedura.
I protocolli che abbiamo impostato per l'immunocolorazione, la pulizia e l'imaging di interi organoidi o sezioni fluttuanti sono semplici, veloci ed economici. La combinazione di tali modelli basati su cellule e l'analisi di imaging 3D su cellule iPS, generate riprogrammando le cellule di perturbazione ciliare o utilizzando la tecnologia CRISPR 9 per modificare specificamente i geni ciliari, dovrebbe consentire progressi significativi nella comprensione del contributo del cilio primario durante lo sviluppo normale e patologico della corteccia cerebrale.
