Общая цель процедуры, которую мы подробно описываем здесь, состоит в том, чтобы препарировать вовлечение первичной реснички во время неокортикального развития. Было показано, что первичные реснички имеют решающее значение для многих этапов неокортикального развития, включая расширение клеток-предшественников, определение судьбы, а также миграцию и созревание нейронов. Для дальнейшего препарирования вовлеченности клеток во время неокортикального развития мы создали соответствующие инструменты, используя преимущества новых 2D и 3D iPS клеточных моделей неокортикального развития.
Другими словами, нервные розетки и органоиды дорсального переднего мозга. 3D iPS клеточные модели начинаются с формирования эмбрионального тела. Адгезия указанных эмбриоидных тел позволяет генерировать 2D нейронные розетки, в то время как свободно плавающие культуры таких ЭБ позволяют генерировать дорсальные органоиды переднего мозга.
Протокол, который мы создали для генерации церебральных органоидов, основан на предыдущих опубликованных протоколах с использованием метода рвотных позывов путем добавления факторов предварительного паттернинга для специфического генерирования дорсальных органоидов переднего мозга с использованием ингибиторов узлового активина и пути BMP, также известного как двойное ингибирование SMAD. Чтобы воспользоваться преимуществами 3D-организации органоидов, мы создали простой и быстрый метод, позволяющий в полной мере иммуномаркировать, очищать и освещать приобретение всего органоида с высоким разрешением. А чтобы сосредоточиться на первичном биогенезе и функциях реснички, мы адаптировали иммуногистохимию на свободно плавающих участках, разрезанных вибратомом.
После иммуноокрашения и очистки участков мы получили изображения с помощью резонансной сканирующей конфокальной микроскопии. Начните с iPS клеточных культур, содержащих большие регулярные колонии, демонстрирующих дифференцировку менее 10% и не более 80% соответствующих. Вручную рассекайте каждую iPS-клеточную колонию с помощью иглы, позволяющей точно улавливать каждую колонию в горизонтальном и вертикальном направлениях, чтобы создать шахматный рисунок, разделив каждую колонию на равные кластеры.
Отсоедините колонию с помощью клеточного скрапера и перенесите их на пластину культивирования со сверхнизким креплением. Пусть они плавают всю ночь в инкубаторе, чтобы они могли образовывать эмбриональные тела. На следующий день переверните среду, следя за тем, чтобы не аспирировать эмбриоидные тела, и перенесите их в блюда, покрытые поли-L-орнитином, до образования нервных розеток.
Это занимает примерно от 12 до 14 дней. Ежедневно обновляйте индукцию, среду и проверяйте под микроскопом формирование нейронных розеточных структур. На этом этапе нейронные розетки могут быть расширены, дифференцированы и обработаны для анализа иммуноокрашивания или диссоциированы, чтобы получить изолированные культуры нервных стволовых и врожденных клеток.
Прежде всего, начните с iPS-культур, скрывающих большие регулярные колонии, демонстрирующие дифференциацию менее 10% и которые были пройдены почти один раз на монослое. На нулевой день позвольте iPS-клетке формировать эмбриоидные тела в среде EB, содержащей низкую концентрацию fJ2 и высокую концентрацию ингибитора ROCK, необходимую для выживания клеток hiiPS, чтобы избежать нарушения пластин инкубатора формирования EB в течение трех дней без изменения среды. На третий день ЭБ должны измерять приблизительно 400 микрометров и показывать регулярные границы.
Если прошлые критерии богаты для большинства ЭБ, измените среду с индукционной средой, содержащую двойные ингибиторы SMAD, безусловно, на осветление контра БД на лучшие шесть-семь, что указывает на снижение нейронной уступки. И они превращают другие БД в показатели базальной мембраны с отрицательным коэффициентом. С этого этапа всегда используйте стерильные ножницы, чтобы получить открытие пептидов, чтобы избежать повреждения органоидов.
Сначала переведите около 15 органоидов в клиническую трубку. Дайте ЭБ осесть и удалите среду на 50 микролитрах индукционной среды два и перенесут органоиды в микрочувствительную трубку, содержащую 100 микролитров матрицы и гомогенизированную путем пипетирования вверх и вниз. Нанесите смесь на центр колодца нейтральной крепежной пластины.
И, наконец, космические ЭБ, чтобы они не касались друг друга, чтобы они не сливались. Дайте веществу затвердеть в инкубаторе в течение 45 минут, добавьте индукционную среду по два в каждую лунку и инкубируйте в инкубаторе. Обновляйте индукционную среду два раза в день.
На 17-й день разъедините матрицу базальной мембраны вручную, пипеткой вверх и вниз 10 раз пипетками из пяти мл. Инкубируют органоидную пластину в трансляционной среде под перемешиванием для улучшения усвоения питательных веществ. Важно отметить, что используйте другой инкубатор для стационарной культуры и культуры на орбитальном шейкере, чтобы избежать любых вибраций, наносящих ущерб для роста адгезивных iPS-клеток.
После фиксации, пермеабилизации, блокирования и инкубации первичными и вторичными антителами проходит 10 дней, включая промывочные этапы. Метод очистки, который мы предпочитали, опирается на TDE, производное гликоля. Для оптимального очищения интубируют органоид в растворе ТДЭ с постепенно-повышенной концентрацией в течение 24 часов каждый.
Для встраивания органоидов используйте специальную основную систему формования, изготовленную из одного мл шприца, наконечник которого отрезается с помощью скальпеля. Рекомендуется низкая температура плавления агарозы, так как температура ее плавления составляет всего около 60 градусов по Цельсию. Приготовьте 4% низкотаплящую агарозу в 60%-ном растворе TDE и дайте ему остыть всего около 37 градусов цельсия в водной основе до органоидного встраивания.
Поместите в шприц 600 микролитров гелевого раствора с помощью плунжера, затем позиционируйте образец и заполните шприц 400 микролитрами гелевого раствора. Дайте гелю полимеризоваться, и, наконец, образец идеально вмонтируется в гель и может быть легко вытолкнут в освещенной камере, чтобы расположить органоид перед объективом. Светящаяся флуоресцентная микроскопия идеально подходит для первой визуализации такого прозрачного органоида.
Мы уменьшили фотовизуализацию и взвесили субклеточное разрешение. Здесь мы использовали 20-кратный объектив, погруженный в 80%-ный раствор TDE, добавленный в камеру для отбора проб, чтобы точно приспособиться к показателю преломления нашего метода очистки. Самый большой заказ образцов был разработан для размещения одномиллилитрового шприца, который может быть вставлен сверху с плунжером, который может работать после того, как заказ образца установлен для позиционирования органоида перед объективом.
Приобретение целого органоида занимает примерно от 5 до 10 минут. Для иммуноокрасления на свободно плавающих участках соберите и зафиксируйте органоиды в четырехместной части на ночь при четырех градусах Цельсия. Встраиваем органоиды в 4% низкоплавкую агарозу и сечение с помощью вибратома для получения 150 микрометров из шести секций, перенесенных в раствор PBS, используя кисть, чтобы избежать их повреждения.
После пермеабилизации и блокировки инкубируют свободно плавающие участки с первичным антителом в течение ночи при четырех градусах Цельсия и под перемешиванием. Тщательно промыть срезы перед инкубацией вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре и при перемешивании. Наконец, для оптимальной очистки инкубируют срез в растворе TDE с постепенно увеличивающейся концентрацией в течение одного часа и 30 в 60% TDE, а затем в 80% TDE в течение ночи при комнатной температуре.
Храните секцию в 80%-ном растворе TDE и TLAC при температуре четыре градуса Цельсия. Установите свободно плавающую секцию в клеточной камере, стремясь поддерживать образец в 80% растворе TDE и предназначен для адаптации на моторизованной стадии клинических микроскопов. Сначала положите один круглый чехол в камеру и аккуратно перенесите прозрачную защиту с помощью кисти.
Заполните камеру раствором 80% TDE, а затем добавьте два стандартных скольжения крышки плюс один второй круглый слип крышки и силиконовое уплотнение. Наконец, навинтите на завинчивающееся кольцо камеры, чтобы идеально герметизировать систему. Nightsheet, а также резонансные захваты обрабатываются благодаря программному обеспечению, позволяющему использовать 3D и анализировать весь образец иммуностира.
Такое программное обеспечение позволяет быстро открывать огромные данные, которые мы генерируем, чтобы легко делать снимки и анимацию. Это позволило перемещать образец в разной ориентации, и мы можем генерировать 2D-виды изображения благодаря инструменту 2D-слайсера в разной ориентации, X, Y и Y, Zed, например. Кроме того, такое программное обеспечение позволяет автоматически обнаруживать как центросомы, так и первичные реснички, что позволяет количественно оценить количество в патологических и контрольных состояниях.
Это также позволяет 3D-восстановление первичных ресничек для точного измерения участков. Протокол, который мы описали для 2D iPS-клеточного моделирования нового коркового развития, позволяет генерировать нейронные розетки, которые содержат новые кортикальные предшественники и нейроны, аналогичные тем, которые наблюдаются в развивающейся неокортексе. Детальная валидация может быть выполнена с помощью обычного иммунонашивающего анализа.
Применимые предшественники должны быть дважды окрашены вместе с нами, чтобы повлиять на чувствительность, в то время как промежуточные предшественники выявляются окрашиванием TBI2 и ранние неокортикальные нейроны кости положительным окрашиванием CTIP2. Такие нейронные розеткоподобные структуры моделируют межкинетическую ядерную миграцию радикальных предшественников, которую можно визуализировать путем иммуноокрашивания антителами, поднятыми против фосфо-виментина, который окрашивает мототические ядра и TBX2, который поддерживает митотическое веретено. Наконец, реснички могут быть проанализированы путем иммуноокрашивания антителами, поднятыми против перицентрических, которые окрашивают заднее тело первичных ресничек и являются определенными средствами, которые окрашивают аксиому.
По такой розетке первичные реснички экстрагируются из апикальных полигениторов Фабри-Кал и плотно возвышаются над центральным просветом каждой вентрикулитной области, при этом они также выступают из CTIP2-положительных нейронов. Диссоциация аденоневральных розеток позволяет генерировать изолированные культуры нервных стволовых и клеток-предшественников, которые очень полезны для анализа биогенеза и функции первичной ресничковой кислоты. В частности, мы подробно описываем процедуру проверки индукции пути звукового препарата после лечения рекомендуемым звуковым препаратом или агонистами осмосина.
Последующие RTPCR SA тестируют индукцию генов-мишеней соника, таких как GLI1 и PTCH1, а иммунофлуоресцентный анализ проверяет динамику ключевых компонентов звукового препарата вдоль первичной реснички, которые получают количественную оценку благодаря инструментам с открытым исходным кодом, ilastik и CiliaQ. Исследуются различные цилиарные параметры, включая длину и ориентацию, но также здесь показана интенсивность компонентов первичной реснички для GLI2 и GPR161, которые, соответственно, накапливаются или выходят из первичной реснички в ответ на рекомендуемое лечение препаратом соника. Протокол, который мы детализируем для 3D-моделирования неокортикального развития на основе iPS-клеток, позволяет генерировать однородные церебральные органоиды с дорсальной идентичностью переднего мозга, которые могут быть охарактеризованы либо обычным иммуноокрашивающим анализом, либо окрашиванием женщины, как показано здесь, с оптимальным проникновением антител, поднятых, опять же, N-кадгерина, PAX6 и CTIP2, которые окрашивают соответственно нейрональный кадгерин, у розовых, апикальных предшественников в желудочковой зоне подобной области, в зеленой, и у всех новорожденных неокортикальных нейронов, расположенных в кортикальной пластинчатой области.
Вот второй фильм всего органоида иммуностинека с снова поднятыми антителами, CTIP2, в красном цвете, возможно, поддерживается в розовом, и TPX2, в зеленом, что позволяет проверить несколько характеристик неокортикальных предшественников, таких как межкинетическая ядерная миграция прародителей Фабри-Кал. Интересно, что положительные предшественники фосфо виментина также наблюдаются в наджелудочковой зоне, подобной области, и содержат уникальный положительный процесс, распространяющийся на положительную поверхность, напоминающий внешние радиальные глиальные прародители и иллюстрирующий высокое разрешение этого метода. Вот фильм об иммуноокрашенном, свободно плавающем участке, приобретенном благодаря резонансно-сканирующему микроскопу, показывающему первичные реснички, обнаруженные с перицентриновой антителой, которая окрашена в заднюю часть тела, в зеленый цвет, и антителами ARLT3B, которые окрашивают аксиому, в розовый цвет.
Первичные реснички простираются от всех нейрональных стволовых и прогениторных клеток, в частности, на эпической поверхности эпических предшественников, а также в неокортикальных нейронах предпластинчатой области. Наконец, розетки 2D-нейронов и изолированные стволовые и прогениторные клетки повторяют несколько аспектов развития коры головного мозга и представляют собой дополнительные, полезные инструменты для проверки цилиарного биогенеза и функции. Протокол, который мы обнаруживаем здесь, позволил нам успешно генерировать органоиды дорсального переднего мозга из этих отдельных клеточных линий iPS, которые приводят к однородным результатам, обеспечивая надежность этой процедуры.
Протоколы, которые мы создали для иммуноокрашения, очистки и визуализации целых органоидов или свободно плавающих участков, просты, быстры и экономически эффективны. Сочетание таких клеточных моделей и анализа 3D-визуализации iPS-клеток, генерируемых либо путем перепрограммирования клеток цилиарного возмущения, либо с использованием технологии CRISPR 9 для специального редактирования цилиарных генов, должно обеспечить значительный прогресс в понимании вклада первичной реснички в нормальное и патологическое развитие коры головного мозга.
