El objetivo general del procedimiento que detallamos aquí es diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical. Los cilios primarios han demostrado ser cruciales para muchos pasos del desarrollo neocortical, incluida la expansión de las células progenitoras, la determinación del destino, así como la migración y maduración neuronal. Para diseccionar aún más la participación celular durante el desarrollo neocortical, establecimos herramientas relevantes aprovechando los modelos emergentes basados en células iPS 2D y 3D del desarrollo neocortical.
En otras palabras, rosetas neurales y organoides del cerebro anterior dorsal. Los modelos 3D basados en células iPS comienzan con la formación del cuerpo embrionario. La adhesión de dichos cuerpos embrioides, permite la generación de estructuras de roseta neural 2D, mientras que el cultivo de flotación libre de dichos EB permite la generación de organoides del cerebro anterior dorsal.
El protocolo que establecimos para generar organoides cerebrales se basa en protocolos publicados anteriormente utilizando el método de amordazamiento mediante la adición de factores de pre-patronaje para generar específicamente organoides del cerebro anterior dorsal mediante el uso de inhibidores de la vía ganglionar de activina y BMP, también conocida como inhibición dual de SMAD. Para aprovechar la organización 3D de los organoides, configuramos un método simple y rápido, que permite el inmunoetiquetado total, la limpieza y la adquisición iluminada de todo el organoide con alta resolución. Y para centrarnos en la biogénesis y las funciones del cilio primario, adaptamos la inmunohistoquímica en secciones de flotación libre cortadas con un vibratome.
Después de la inmunotinción y el despeje de las secciones, adquirimos las imágenes mediante microscopía confocal de barrido resonante. Comience con cultivos celulares iPS que albergan grandes colonias regulares, que exhiben menos del 10% de diferenciación y no cumplen con el 80%. Diseccionar manualmente cada colonia de células iPS usando una aguja, lo que permite atrapar precisamente cada colonia en direcciones horizontales y verticales para crear un patrón de tablero de ajedrez, dividiendo cada colonia en grupos iguales.
Separe la colonia con un raspador de células y transfiéralas a una placa de cultivo de fijación ultra baja. Déjelos flotar durante la noche en la incubadora para que puedan formar cuerpos embrionarios. Al día siguiente, gire el medio, teniendo cuidado de no aspirar los cuerpos embrionarios, y transfiéralos a platos recubiertos de Poly-L-ornitina Laminine hasta la formación de rosetas neurales.
Eso toma aproximadamente de 12 a 14 días. Inducción de actualización diaria, medio y verificación bajo microscopio para detectar la formación de estructuras de roseta neural. A partir de este paso, las rosetas neurales se pueden expandir, diferenciar y procesar para el análisis de inmunotinción o disociarse para obtener cultivos aislados de células madre neurales y progenitales.
En primer lugar, comience con las culturas iPS que albergan grandes colonias regulares que exhiben menos del 10% de diferenciación y que se han pasado casi una vez en la monocapa. En el día cero, permita que las células iPS formen cuerpos embrioides en medio EB que contengan una baja concentración de fJ2 y una alta concentración de inhibidor de ROCK requerida para la supervivencia de las células hiiPS para evitar perturbar las placas incubadoras de formación de EB durante tres días sin cambio medio. En el tercer día, los EB deben medir aproximadamente 400 micrómetros y mostrar bordes regulares.
Si los criterios anteriores son ricos para la mayoría de los EB, cambie el medio con el medio de inducción uno que contenga inhibidores duales de SMAD ciertamente para iluminar los contra DB en mejor seis a siete, lo que indica una concesión neuronal de tomaly. Y convierten otras bases de datos en métricas de membrana basal reducidas por factor bruto. A partir de este paso utiliza siempre tijeras estériles para conseguir la apertura de los péptidos para evitar dañar los organoides.
Primero transfiera alrededor de 15 organoides a un tubo clínico. Deje que el EB se asiente y retire el medio a 50 microlitros del medio de inducción dos y transfiera los organoides a un tubo microsensible que contiene 100 microlitros de matriz y homogeneizado por pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Extienda la mezcla en el centro de un pozo de una placa de fijación neutra.
Y por último, espaciar los EB para que no se toquen entre sí para evitar que se fusionen. Deje que la materia se solidifique en la incubadora durante 45 minutos, agregue el medio de inducción dos a cada pozo e incube en la incubadora. Refrescar el medio de inducción dos cada dos días.
El día 17, disociar manualmente la matriz de la membrana basal mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces con pipetas de cinco ml. Incubar la placa organoide en el medio de traslación uno bajo agitación para mejorar la absorción nutricional. Es importante destacar que use una incubadora diferente para el cultivo estacionario y el cultivo en el agitador orbital para evitar cualquier vibración perjudicial para el crecimiento de células iPS adherentes.
Después de la fijación, la permeabilización, el bloqueo y la incubación con anticuerpos primarios y secundarios tarda 10 días, incluidos los pasos de lavado. El método de compensación que favorecimos se basa en TDE, un derivado del glicol. Para un aclaramiento óptimo, intubar el organoide en solución de TDE con un aumento gradual de la concentración durante 24 horas cada uno.
Para la incrustación de organoides, use un sistema de moldeo principal personalizado hecho de la jeringa de un ml, cuya punta se corta con un bisturí. Se recomienda un bajo punto de fusión de Agarosa, ya que su temperatura de fusión es de solo aproximadamente 60 grados centígrados. Prepare Agarosa de fusión baja al 4% en solución de TDE al 60% y deje que se enfríe aproximadamente a 37 grados Celsius en una incrustación pre-organoide a base de agua.
Coloque en la jeringa 600 microlitros de la solución de gel usando el émbolo, luego coloque la muestra y llene la jeringa con 400 microlitros de la solución de gel. Deje que el gel polimerice y, finalmente, la muestra se monta idealmente dentro del gel y se puede empujar fácilmente dentro de la cámara iluminada para colocar el organoide frente al objetivo. La microscopía de fluorescencia iluminada es ideal para la primera toma de imágenes de un organoide tan claro.
Hemos reducido las imágenes fotográficas y sopesado la resolución subcelular. Aquí, utilizamos un objetivo 20x sumergido en una solución de TDE al 80% agregada en la cámara de muestra para permitir ajustar con precisión al índice de refracción de nuestro método de limpieza. El orden de muestra más grande se ha diseñado para acomodar una jeringa de un mililitro que se puede insertar desde la parte superior con el émbolo que se puede operar una vez que se monta el orden de muestra para colocar el organoide frente al objetivo.
La adquisición de un organoide completo toma aproximadamente de 5 a 10 minutos. Para la inmunomantación en secciones que flotan libremente, recoja y fije sus organoides en una parte de cuatro personas durante la noche a cuatro grados centígrados. Incruste los organoides en agarosa y sección de baja fusión al 4% mediante el uso de un vibratomo para obtener 150 micrómetros de seis secciones transferidas en solución de PBS, utilizando un pincel para evitar dañarlos.
Después de la permeabilización y el bloqueo, incubar las secciones de flotación libre con anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados y bajo agitación. Lave las secciones cuidadosamente antes de la incubación con anticuerpos secundarios durante dos horas a temperatura ambiente y bajo agitación. Finalmente, para un aclaramiento óptimo, incube la sección en solución de TDE con un aumento gradual de la concentración durante una hora y 30 en 60% de TDE y luego en 80% de TDE durante la noche a temperatura ambiente.
Almacene la sección en una solución 80% TDE y TLAC a cuatro grados centígrados. Monte una sección de flotación libre en una cámara celular, esforzándose por mantener la muestra en una solución de TDE al 80% y diseñada para adaptarse a una etapa motorizada de microscopios clínicos. Primero, coloque un resbalón de cubierta redonda en la cámara y transfiera cuidadosamente la protección transparente con un pincel.
Llene la cámara con una solución de TDE al 80% y luego agregue dos deslizamientos de cubierta estándar más un segundo deslizamiento de cubierta redondo y un sello de silicio. Finalmente, atornille el anillo de atornillado de la cámara para sellar perfectamente el sistema. Nightsheet, así como las adquisiciones de resonancia se procesan gracias a un software que permite la utilización en 3D y un análisis de toda la muestra de inmunotinción.
Dicho software le permite abrir rápidamente los enormes datos que generamos para hacer fácilmente instantáneas y animaciones. Permitió mover la muestra en diferentes orientaciones y podemos generar vistas 2D de la imagen gracias a una herramienta de segmentación de datos 2D en diferente orientación, X, Y e Y, Zed, por ejemplo. Además, dicho software permite la detección automática tanto del centrosoma como de los cilios primarios, lo que permite cuantificar el número en condiciones patológicas frente a las de control.
También permite la reconstitución 3D de cilios primarios para una medición precisa de los sitios. El protocolo que describimos para el modelado basado en células iPS 2D del nuevo desarrollo cortical permite la generación de estructuras de rosetas neurales que contienen nuevos progenitores corticales y neuronas similares a las observadas en el neocórtex en desarrollo. La validación detallada se puede realizar mediante análisis de inmunotinción convencional.
Los progenitores aplicables deben teñirse dos veces con nosotros para afectar las sensibilidades, mientras que los progenitores intermedios se revelan por tinción TBI2 y las neuronas neocorticales óseas tempranas por tinción positiva CTIP2. Tales estructuras neuronales similares a rosetas modelan la migración nuclear intercinética de progenitores radicales que se puede visualizar mediante inmunotinción con anticuerpos elevados contra la fosfovimentina que tiñen los núcleos micóticos y TBX2 que sostiene el huso mitótico. Por último, la ciliagénesis se puede analizar mediante inmunotinción con anticuerpos elevados contra el pericéntrico, que tiñen el cuerpo posterior de los cilios primarios y son de ciertos medios que tiñen el axioma.
En dicha estructura de roseta, los cilios primarios extrajeron de los progenitores apicales poli Fabri-Kal y densamente por encima de la luz central de cada región de ventrículo, mientras que también sobresalen de las neuronas CTIP2 positivas. La disociación de rosetas adenoneurales permite generar cultivos aislados de células madre neurales y progenitoras que son de gran utilidad para analizar la biogénesis y función del cilio primario. En particular, detallamos el procedimiento para probar la inducción de la vía del fármaco sónico después del tratamiento con fármacos sónicos recomendados o agonistas de la osmosina.
Posteriormente RTPCR SA prueba la inducción de genes diana de fármacos sonica, como GLI1 y PTCH1, y el análisis de inmunofluorescencia prueba la dinámica de los componentes clave de los fármacos sónicos a lo largo del cilio primario que se cuantifican, gracias a las herramientas de código abierto, ilastik y CiliaQ. Se investigan diferentes parámetros ciliares, incluida la longitud y la orientación, pero también se muestra la intensidad de los componentes primarios del cilio para GLI2 y GPR161 que, respectivamente, se acumulan o salen del cilio primario en respuesta al tratamiento farmacológico sonica recomendado. El protocolo que detallamos para el modelado 3D basado en células iPS del desarrollo neocortical permite la generación de organoides cerebrales homogéneos con identidad del cerebro anterior dorsal que pueden caracterizarse ya sea por análisis de inmunotinción convencional o por tinción de mujer, como se muestra aquí, con una penetración óptima de los anticuerpos levantados, nuevamente, N-cadherina, PAX6 y CTIP2 que tiñen respectivamente la cadherina neuronal, en rosa, progenitores apicales en la región similar a la zona ventricular, en verde, y todas las neuronas neocorticales recién nacidas, ubicadas en la región similar a la placa cortical.
Aquí hay una segunda película de todo el organoide de inmunotinción con anticuerpos levantados nuevamente, CTIP2, en rojo, posiblemente mantenido en rosa, y TPX2, en verde, lo que permite probar varias características de los progenitores neocorticales, como la migración nuclear intercinética de los progenitores de Fabri-Kal. Curiosamente, los progenitores positivos de fosfovimentina también se observan en la región de la zona supraventricular y albergan un proceso positivo único que se extiende a la superficie positiva, que recuerda a los progenitores gliales radiales externos e ilustra la alta resolución de este método. Aquí hay una película de una sección de inmunotinción, que flota libremente, adquirida gracias a un microscopio de resonancia que muestra cilios primarios detectados con anticuerpos de pericentrina que se tiñen la parte posterior del cuerpo, en verde, y anticuerpos ARLT3B que tiñen el axioma, en rosa.
Los cilios primarios se extienden desde todas las células madre y progenitoras neuronales, en particular, en la superficie epical de los progenitores epicales, pero también en las neuronas neocorticales de la región similar a la preplaca. Finalmente, las rosetas de neuronas 2D y las células madre y progenitoras aisladas recapitulan varios aspectos del desarrollo cortical cerebral y representan herramientas complementarias y útiles para probar la biogénesis y la función ciliar. El protocolo que detectamos aquí nos permitió generar con éxito organoides del cerebro anterior dorsal a partir de estas distintas líneas celulares iPS que dan lugar a resultados homogéneos, asegurando la robustez de este procedimiento.
Los protocolos que establecimos para la inmunotinción, limpieza e imágenes de organoides enteros o secciones que flotan libremente son simples, rápidos y rentables. La combinación de tales modelos basados en células y el análisis de imágenes 3D en células iPS, generados ya sea mediante la reprogramación de células de perturbación ciliar o mediante el uso de la tecnología CRISPR 9 para editar específicamente genes ciliares, debería permitir un progreso significativo en la comprensión de la contribución del cilio primario durante el desarrollo normal y patológico de la corteza cerebral.
