Burada detaylandırdığımız prosedürün genel amacı, neokortik gelişim sırasında primer sezyumun tutulumunun diseksiyonudur. Primer cilia, progenitor hücre genişlemesi, kader belirleme, nöronal göç ve olgunlaşma dahil olmak üzere birçok neokortik gelişim adımı için çok önemli gösterilmiştir. Neokortik gelişim sırasında hücre tutulumunun daha fazla incelenerek, ortaya çıkan 2D ve 3D iPS hücre tabanlı neokortik gelişim modellerinden yararlanarak ilgili araçları kurduk.
Başka bir deyişle, nöral rozetler ve sırt forebrain organoidleri. 3D iPS hücre bazlı modeller embriyoid vücut oluşumu ile başlar. Söz konusu embriyoid cisimlerinin yapışmasını, 2D nöral rozet yapılarının üretilmesine izin verirken, bu tür EB'lerin serbest yüzen kültürü dorsal forebrain organoidlerinin üretilmesine izin verir.
Serebral organoid üretmek için kurduğumuz protokol, çift SMAD inhibisyonu olarak da bilinen activin nodal ve BMP yolunun inhibitörlerini kullanarak özellikle dorsal forebrain organoidleri oluşturmak için ön desenleme faktörleri ekleyerek öğürme yöntemini kullanarak önceki yayınlanan protokollere dayanmaktadır. Organoidlerin 3D organizasyonundan yararlanmak için, tüm organoidin yüksek çözünürlükte tamamen immünolabeling, temizleme ve ışıklı edinimine izin vererek basit ve hızlı bir yöntem belirledik. Primer setom biyogenez ve fonksiyonlarına odaklanmak için immünhistokimyayı vibratomla kesilen serbest yüzen bölümlere uyarladık.
Bölümlerin immünostaining ve temizlenmesinden sonra, rezonans tarama konfokal mikroskopisi kullanarak görüntüleri elde ettik. Büyük düzenli kolonileri barındıran, %10'dan daha az farklılaşma sergileyen ve %80'den fazla uyumlu olmayan iPS hücre kültürleriyle başlayın. Her iPS hücre kolonisini bir iğne kullanarak manuel olarak inceleyin, her koloniyi yatay ve dikey yönlerde tam olarak yakalamaya izin vererek bir dama tahtası deseni oluşturun ve her koloniyi eşit kümelere bölün.
Koloniyi bir hücre kazıyıcı kullanarak ayırın ve ultra düşük bir bağlantı kültür plakasına aktarın. İnkübatörde gece boyunca yüzmelerine izin verin, böylece embriyoid vücutlar oluşturabilirler. Ertesi gün, embriyoid vücutlarını aspire etmemeye dikkat ederek ortamı çevirin ve sinir rozetlerinin oluşumuna kadar Poli-L-ornitin Lamin kaplamalı yemeklere aktarın.
Bu yaklaşık 12 ila 14 gün sürer. Günlük yenileme indüksiyonu, orta ve nöral rozet yapılarının oluşumunu mikroskop altında kontrol edin. Bu adımdan itibaren, nöral rozetler genişletilebilir, farklılaştırılabilir ve immünostaining analizi için işlenebilir veya izole nöral kök ve progenital hücre kültürleri elde etmek için ilişkisi kesilebilir.
Her şeyden önce, %10'dan daha az farklılaşma gösteren ve monolayerde neredeyse bir kez geçiş yapan büyük düzenli kolonileri barındıran iPS kültürleriyle başlayın. Sıfır gününde, iPS hücresinin EB ortamında düşük fJ2 konsantrasyonu ve hiiPS hücre sağkalımının orta değişiklik olmadan üç gün boyunca rahatsız edici EB formasyon inkübatör plakalarını önlemek için gereken yüksek konsantrasyonda ROCK inhibitörü içeren embriyoid cisimler oluşturmasına izin verin. Üçüncü gün, EBs yaklaşık 400 mikrometre ölçmeli ve düzenli sınırlar göstermelidir.
Çoğu EB için zengin geçmiş kriterler varsa, çift SMAD inhibitörleri içeren indüksiyon ortamı ile ortamı kesinlikle nöral tomaly imtiyazını gösteren en iyi altı ila yedi kontra DBs'yi aydınlatmak için değiştirin. Ve diğer DB'leri brüt faktörlü azaltılmış bodrum membran metriklerine dönüştürüyorlar. Bu adımdan organoidlerin zarar vermemesi için peptitlerin açılmasını sağlamak için her zaman steril makas kullanın.
İlk olarak yaklaşık 15 organoidi klinik bir tüpe aktarın. EB'nin ortamı 50 mikrolitre indüksiyon ortamına yerleşip çıkarmasına izin verin ve organoidleri 100 mikrolitre matris içeren ve yukarı ve aşağı pipetleme ile homojenize edilen mikrosensitive bir tüpe aktarın. Karışımı nötr bir bağlantı plakasının kuyusunun ortasına yayın.
Ve son olarak, uzay EBs, kaynaşmalarını önlemek için birbirlerine dokunmamaları için. Maddeyi inkübatörde 45 dakika katılaştırın, her kuyuya iki indüksiyon ortamı ekleyin ve inkübatörde kuluçkaya yatırın. İndüksiyon ortamını iki günde bir yenileyin.
17. günde, beş ml pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak bodrum membran matrisini manuel olarak ayırın. Besin emilimini iyileştirmek için ajitasyon altında çeviri ortamında organoid plakayı kuluçkaya yatırın. Daha da önemlisi, bağlı iPS hücre büyümesi için zararlı titreşimleri önlemek için yörüngesel çalkalayıcıda sabit kültür ve kültür için farklı bir inkübatör kullanın.
Fiksasyon, permeabilizasyon, bloke etme ve birincil ve ikincil antikorlarla inkübasyondan sonra yıkama adımları da dahil olmak üzere 10 gün sürer. Tercih ettiğimiz takas yöntemi glikol türevi olan TDE'ye dayanıyor. Optimum temizleme için, organoidi TDE çözeltisinde her biri 24 saat boyunca kademeli olarak artırılmış konsantrasyonla entübe edin.
Organoid gömme için, ucu neşter kullanılarak kesilen bir ml şırıngdan yapılmış özel ana kalıplama sistemini kullanın. Erime sıcaklığı sadece yaklaşık 60 santigrat derece olduğu için düşük erime noktası Agarose önerilir. %4 düşük erime Agarose'u %60 TDE çözeltisinde hazırlayın ve organoid öncesi bir su tabanında yaklaşık 37 santigrat derece soğumasını bekleyin.
Pistonu kullanarak jel çözeltisinin şırınga 600 mikrolitresini koyun, ardından numuneyi yerleştirin ve şırıngayı jel çözeltisinin 400 mikrolitresi ile doldurun. Jelin polimerize olmasına izin verin ve son olarak, numune jelin içine ideal bir şekilde monte edilir ve organoidi hedefin önüne konumlandırmak için ışıklı odanın içine kolayca itilebilir. Işıklı floresan mikroskopisi, bu kadar net organoidin ilk görüntülenmesi için idealdir.
Fotoğraf görüntülemeyi azalttık ve hücresel çözünürlükte ağırlık yaptık. Burada, temizleme yöntemimizin kırılma indeksine doğru bir şekilde uyum sağlamak için numune odasına eklenen% 80 TDE çözeltisinde 20x hedef kullandık. En büyük örnek sipariş, organoidi hedefin önüne konumlandırmak için numune sırası monte edildikten sonra çalıştırılabilen piston ile üstten takılabilen bir mililitrelik şırınnayı barındıracak şekilde tasarlanmıştır.
Tüm bir organoidin eldei yaklaşık 5 ila 10 dakika sürer. Serbest yüzen bölümlerde immün boyama için organoidlerinizi dört santigrat derecede bir gecede dört kişilik parça halinde toplayın ve sabitlayın. ORGANOIDLerİ% 4 düşük eriyen Agarose'a ve bölüme, PBS çözeltisinde aktarılan altı bölümden 150 mikrometre elde etmek için bir vibratom kullanarak, zarar vermemek için bir boya fırçası kullanarak gömün.
Permeabilizasyon ve blokajdan sonra, serbest yüzen bölümleri dört santigrat derecede ve ajitasyon altında bir gecede birincil antikor ile kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan önce bölümleri oda sıcaklığında ve ajitasyon altında iki saat boyunca ikincil antikorla dikkatlice yıkayın. Son olarak, optimum temizleme için, bölümü TDE çözeltisinde bir saat boyunca kademeli olarak artırılmış konsantrasyonla ve% 60 TDE'de 30'da ve daha sonra oda sıcaklığında gece boyunca% 80 TDE'de kuluçkaya yatırın.
Bölümü %80 TDE ve TLAC çözümünde dört santigrat derecede saklayın. Serbest yüzen bölümü bir hücre odasına monte edin, numuneyi% 80 TDE çözeltisinde korumaya çalışır ve klinik mikroskopların motorlu bir aşamasına uyum sağlamak için tasarlanmıştır. İlk olarak, odaya bir yuvarlak kapak kayması koyun ve bir boya fırçası kullanarak açık korumayı dikkatlice aktarın.
Hazneyi %80 TDE çözeltisi ile doldurun ve ardından iki standart kapak fişi artı bir ikinci yuvarlak kapak fişi ve bir Silikon conta ekleyin. Son olarak, sistemi mükemmel bir şekilde kapatmak için haznenin vidalama halkasını vidaleyin. Nightsheet ve rezonans alımları, 3D kullanımı sağlayan bir yazılım ve tüm immünostain örneğinin analizi sayesinde işlenir.
Bu tür yazılımlar, kolayca anlık görüntüler ve animasyonlar yapmak için ürettiğimiz büyük verileri hızla açmanıza izin verir. Örneğin X, Y ve Y, Zed gibi farklı yöndeki bir 2D dilimleyici aracı sayesinde numunenin farklı yönde hareket etmesine izin verdi ve görüntünün 2D görünümlerini oluşturabiliriz. Buna ek olarak, bu tür yazılımlar hem centrosome hem de birincil cilia'nın otomatik olarak algılanmasını sağlayarak patolojik ve kontrol koşullarında sayıyı ölçmeyi sağlar.
Ayrıca, sitelerin hassas ölçümü için birincil cilia'nın 3D yeniden uzlaştırılmasına izin verir. Yeni kortikal gelişimin 2D iPS hücre bazlı modellemesi için açıkladığımız protokol, gelişmekte olan neokortekste görülenlere benzer yeni kortikal progenitörler ve nöronlar içeren nöral rozet yapılarının üretilmesine izin verir. Konvansiyonel immünostainasyon analizi ile detaylı doğrulama yapılabilir.
Uygulanabilir progenitörler, ara alerjenler TBI2 boyama ve erken kemik neokortik nöronları CTIP2 pozitif boyama ile ortaya çıkarken, hassasiyetleri etkilemek için bizimle çift lekelenmelidir. Bu tür nöral rozet benzeri yapılar, mitotik iğdeyi sürdüren mototik çekirdeği ve TBX2'yi lekeleyen fosfosin canlılarına karşı yükseltilen antikorlarla immünostainleme ile görselleştirilebilen radikal ataların interkinetik nükleer göçlerini modeller. Son olarak, siliagenezi perisantrik karşı yükseltilmiş antikorlar ile immünostaining ile analiz edilebilir, primer cilia arka vücut lekeler ve aksiyom lekeler belirli araçlardır.
Bu rozet yapısında, apikal poli Fabri-Kal progenitörlerinden çıkarılan birincil cilia ve yoğun olarak her ventrikülit bölgesinin merkezi lümeninin üzerinde, aynı zamanda CTIP2-pozitif nöronlardan çıkıntı yapıyorlar. Adenoneural rozetlerin ayrışması, birincil selyum biyogenezini ve işlevini analiz etmek için oldukça yararlı olan izole nöral kök ve progenitör hücre kültürleri üretmeyi sağlar. Özellikle, önerilen sonik ilaç veya osmosin agonistleri ile tedaviden sonra sonik ilaç yolunun indüksiyonunu test etmek için prosedürü detaylandırıyoruz.
Sonraki RTPCR SA, GLI1 ve PTCH1 gibi sonika ilaç hedef genlerinin indüksiyonunu test eder ve immünoresans analizi, açık kaynak araçlar, ilastik ve CiliaQ sayesinde ölçülen birincil sicim boyunca anahtar sonik ilaç bileşenlerinin dinamiklerini test eder. Uzunluk ve oryantasyon da dahil olmak üzere farklı silier parametreler araştırılır, ancak gli2 ve GPR161 için birincil siliyum bileşenlerinin yoğunluğu da burada gösterilmiştir, sırasıyla, önerilen sonica ilaç tedavisine yanıt olarak birincil siliyumdan birikir veya çıkar. Neokortik gelişimin 3D iPS hücre bazlı modellemesi için detaylandırdığımız protokol, geleneksel immünostain analizi veya kadın lekeleme ile karakterize edilebilen dorsal forebrain kimliğine sahip homojen serebral organoidin üretilmesine izin verir, burada gösterildiği gibi, yükseltilen antikorların optimal penetrasyonu ile, yine, sırasıyla nöronal cadherin lekeleyen N-cadherin, PAX6 ve CTIP2, bölge gibi ventrikül bölgesinde pembe, apikal progenitörlerde, yeşilde ve kortikal plakada bulunan tüm yenidoğan neokortik nöronlarda.
İşte tüm immünostain organoidinin tekrar yükseltilen antikorlarla ikinci bir filmi, kırmızıda CTIP2, muhtemelen pembede muhafaza edilir ve TPX2, yeşil olarak, Fabri-Kal atalarının interkinetik nükleer göçü gibi neokortik progenitörlerin çeşitli özelliklerini test etmeye izin verir. İlginçtir ki, fosfovisin pozitif ataları da bölge gibi supraventriküler bölgede gözlenir ve pozitif yüzeye uzanan, dış radyal glial progenitörleri andıran ve bu yöntemin yüksek çözünürlüğünü gösteren benzersiz bir pozitif süreç barındırır. İşte vücudun arkasını lekeleyen perisantrik antikor ile tespit edilen birincil ciliayı gösteren rezonans tarama mikroskobu sayesinde elde edilen immünostain, serbest yüzen bir bölümün filmi, yeşil ve aksiyomu lekeleyen ARLT3B antikorları pembe.
Primer cilia, tüm nöronal kök ve progenitör hücrelerden, özellikle epik progenitörlerin epik yüzeyinden, aynı zamanda ön plaka benzeri bölgenin neokortik nöronlarında uzanır. Son olarak 2D nöron rozetleri ve izole kök ve progenitör hücreler serebral kortikal gelişimin çeşitli yönlerini yeniden özetler ve silier biyogenez ve fonksiyonu test etmek için tamamlayıcı, yararlı araçları temsil eder. Burada tespit ettiğimiz protokol, homojen sonuçlara yol açan bu farklı iPS hücre hatlarından başarılı bir şekilde dorsal forebrain organoidleri üretmemizi sağlayarak bu prosedürün sağlamlığını sağladı.
Tüm organoidlerin veya serbest yüzen bölümlerin immünostaining, temizleme ve görüntüleme için kurduğumuz protokoller basit, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu tür hücre bazlı modellerin ve 3D görüntüleme analizlerinin iPS hücreleri üzerinde birleştirilmesi, silier pertürbasyon hücrelerinin yeniden programlanması veya özellikle silier genleri düzenlemek için CRISPR 9 teknolojisinin kullanılmasıyla, serebral korteksin normal ve patolojik gelişimi sırasında birincil siliyumun katkısının anlaşılmasında önemli ilerlemeler sağlanmalıdır.
