Das übergeordnete Ziel des Verfahrens, das wir hier beschreiben, ist es, die Beteiligung von primärem Cilium während der neokortikalen Entwicklung zu sezieren. Primäre Zilien haben sich als entscheidend für viele Schritte der neokortikalen Entwicklung erwiesen, einschließlich der Erweiterung der Vorläuferzellen, der Schicksalsbestimmung sowie der neuronalen Migration und Reifung. Um die Zellbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung weiter zu sezieren, haben wir relevante Werkzeuge eingerichtet, indem wir die Vorteile neuer 2D- und 3D-iPS-zellbasierter Modelle der neokortikalen Entwicklung nutzen.
Mit anderen Worten, neuronale Rosetten und dorsale Vorderhirn-Organoide. 3D-iPS-zellbasierte Modelle beginnen mit der embryonalen Körperbildung. Die Adhäsion dieser embryoiden Körper ermöglicht die Erzeugung von 2D-neuronalen Rosettenstrukturen, während die frei schwebende Kultur solcher EBs die Erzeugung von dorsalen Vorderhirnorganoiden ermöglicht.
Das Protokoll, das wir zur Erzeugung zerebraler Organoide eingerichtet haben, basiert auf zuvor veröffentlichten Protokollen, die die Gagging-Methode verwenden, indem Prästrukturierungsfaktoren hinzugefügt werden, um spezifisch dorsale Vorderhirn-Organoide zu erzeugen, indem Inhibitoren des Aktivin-Knotens und des BMP-Signalwegs verwendet werden, auch bekannt als duale SMAD-Hemmung. Um die Vorteile der 3D-Organisation der Organoide zu nutzen, haben wir eine einfache und schnelle Methode eingerichtet, die eine vollständige Immunmarkierung, Klärung und beleuchtete Erfassung des gesamten Organoids mit hoher Auflösung ermöglicht. Und um uns auf die primäre Cilium-Biogenese und -Funktionen zu konzentrieren, haben wir die Immunhistochemie an frei schwebenden Abschnitten angepasst, die mit einem Vibratom geschnitten wurden.
Nach der Immunfärbung und Klärung der Abschnitte haben wir die Bilder mit resonanter Rasterkonfokalmikroskopie aufgenommen. Beginnen Sie mit iPS-Zellkulturen, die große regelmäßige Kolonien beherbergen, weniger als 10% Differenzierung aufweisen und nicht mehr als 80% konform sind. Sezieren Sie jede iPS-Zellkolonie manuell mit einer Nadel, so dass jede Kolonie in horizontaler und vertikaler Richtung genau aufgefangen werden kann, um ein Schachbrettmuster zu erzeugen, das jede Kolonie in gleiche Cluster unterteilt.
Lösen Sie die Kolonie mit einem Zellabstreifer und übertragen Sie sie auf eine Kulturplatte mit extrem niedrigem Aufsatz. Lassen Sie sie über Nacht im Inkubator schweben, damit sie embryoide Körper bilden können. Drehen Sie am nächsten Tag das Medium, achten Sie darauf, die embryoiden Körper nicht abzusaugen, und übertragen Sie sie in Poly-L-Ornithin-Laminine-beschichtete Schalen bis zur Bildung von neuronalen Rosetten.
Das dauert ungefähr 12 bis 14 Tage. Tägliche Induktion, Medium und Überprüfung unter dem Mikroskop auf Bildung von neuronalen Rosettenstrukturen. Aus diesem Schritt können neuronale Rosetten erweitert, differenziert und für die Immunfärbungsanalyse verarbeitet oder dissoziiert werden, um isolierte neurale Stamm- und Vorläuferzellkulturen zu erhalten.
Beginnen wir zunächst mit iPS-Kulturen, die große regelmäßige Kolonien beherbergen, die weniger als 10% Differenzierung aufweisen und fast einmal auf der Monoschicht durchquert wurden. Erlauben Sie der iPS-Zelle am Tag Null, embryoide Körper in EB-Medium zu bilden, die eine geringe Konzentration von fJ2 und eine hohe Konzentration von ROCK-Inhibitoren enthalten, die für das Überleben von HiiPS-Zellen erforderlich sind, um zu vermeiden, dass die EB-Formations-Inkubatorplatten für drei Tage ohne mittlere Veränderung gestört werden. Am dritten Tag sollten EBs etwa 400 Mikrometer messen und regelmäßige Grenzen aufweisen.
Wenn vergangene Kriterien für die meisten EBs reich sind, ändern Sie das Medium mit Induktionsmedium eins, das duale SMAD-Inhibitoren enthält, um die Contra-DBs um die besten sechs bis sieben aufzuhellen, was auf eine neuronale Tomaly-Konzession hinweist. Und sie verwandeln andere DBs in bruttofaktorreduzierte Basalmembranmetriken. Verwenden Sie ab diesem Schritt immer eine sterile Schere, um die Öffnung der Peptide zu erhalten, um eine Beschädigung der Organoide zu vermeiden.
Zuerst etwa 15 Organoide in einen klinischen Schlauch übertragen. Lassen Sie das EB absetzen und entfernen Sie das Medium bei 50 Mikrolitern Desduktionsmediums zwei und übertragen Sie die Organoide in ein mikroempfindliches Röhrchen, das 100 Mikroliter Matrix enthält und durch Pipettieren nach oben und unten homogenisiert wird. Verteilen Sie die Mischung auf die Mitte einer Vertiefung einer neutralen Befestigungsplatte.
Und schließlich, Space EBs, so dass sie sich nicht berühren, um zu vermeiden, dass sie verschmelzen. Lassen Sie die Materie im Inkubator für 45 Minuten erstarren, fügen Sie jedem Brunnen in das Induktionsmedium zwei hinzu und inkubieren Sie im Inkubator. Aktualisieren Sie das Induktionsmedium zwei jeden zweiten Tag.
Dissoziieren Sie am Tag 17 die Basalmembranmatrix manuell, indem Sie 10 Mal mit fünf ml Pipetten nach oben und unten pipettieren. Inkubieren Sie die Organoidplatte im Translationsmedium unter Erregung, um die Nahrungsaufnahme zu verbessern. Es ist wichtig, einen anderen Inkubator für die stationäre Kultur und die Kultur auf dem Orbitalschüttler zu verwenden, um Vibrationen zu vermeiden, die für das wachstum anhaftender iPS-Zellen schädlich sind.
Nach der Fixierung dauert die Permeabilisierung, Blockierung und Inkubation mit primären und sekundären Antikörpern 10 Tage, einschließlich Waschschritte. Die von uns favorisierte Clearing-Methode beruht auf TDE, einem Glykolderivat. Für eine optimale Reinigung das Organoid in TDE-Lösung mit allmählich erhöhter Konzentration für jeweils 24 Stunden intubieren.
Verwenden Sie für die Organoideinbettung ein benutzerdefiniertes Hauptformsystem, das aus der Ein-ml-Spritze hergestellt wird, deren Spitze mit einem Skalpell abgeschnitten wird. Niedriger Schmelzpunkt Agarose wird empfohlen, da seine Schmelztemperatur nur etwa 60 Grad Celsius beträgt. Bereiten Sie 4% niedrigschmelzende Agarose in 60% TDE-Lösung vor und lassen Sie sie in einer Wasserbasis-Präorganoid-Einbettung nur etwa 37 Grad Celsius abkühlen.
Geben Sie in die Spritze 600 Mikroliter der Gellösung mit dem Kolben, positionieren Sie dann die Probe und füllen Sie die Spritze mit 400 Mikrolitern der Gellösung. Lassen Sie das Gel polymerisieren, und schließlich wird die Probe idealerweise im Gel montiert und kann leicht in der beleuchteten Kammer herausgeschoben werden, um das Organoid vor dem Objektiv zu positionieren. Die beleuchtete Fluoreszenzmikroskopie ist ideal für die erste Abbildung eines solchen klaren Organoids.
Wir haben die Fotobildgebung reduziert und die subzelluläre Auflösung gewogen. Hier verwendeten wir ein 20-faches Objektiv, das in 80% TDE-Lösung eingetaucht war und in die Probenkammer gegeben wurde, um eine genaue Anpassung an den Brechungsindex unserer Clearing-Methode zu ermöglichen. Die größte Probenbestellung wurde entwickelt, um eine Ein-Milliliter-Spritze aufzunehmen, die von oben mit dem Kolben eingeführt werden kann, der bedient werden kann, sobald die Probenreihenfolge montiert ist, um das Organoid vor dem Objektiv zu positionieren.
Die Aufnahme eines ganzen Organoids dauert ca. 5 bis 10 Minuten. Für die Immunfärbung auf frei schwebenden Abschnitten sammeln und fixieren Sie Ihre Organoide im Vier-Personen-Teil über Nacht bei vier Grad Celsius. Betten Sie die Organoide in 4% niedrigschmelzende Agarose und Schnitt ein, indem Sie ein Vibratom verwenden, um 150 Mikrometer von sechs Abschnitten zu erhalten, die in PBS-Lösung übertragen werden, und verwenden Sie einen Pinsel, um eine Beschädigung zu vermeiden.
Nach der Permeabilisierung und Blockierung inkubieren Sie die frei schwebenden Abschnitte mit primärem Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius und unter Bewegung. Waschen Sie die Abschnitte sorgfältig vor der Inkubation mit sekundären Antikörpern für zwei Stunden bei Raumtemperatur und unter Rühren. Schließlich wird für eine optimale Reinigung der Abschnitt in TDE-Lösung mit allmählich erhöhter Konzentration für eine Stunde und 30 in 60% TDE und dann in 80% TDE über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Lagern Sie den Abschnitt in 80% TDE- und TLAC-Lösung bei vier Grad Celsius. Montieren Sie einen frei schwebenden Abschnitt in einer Zellkammer, um die Probe in 80% TDE-Lösung zu halten und so konzipiert zu sein, dass sie sich an eine motorisierte Stufe klinischer Mikroskope anpasst. Legen Sie zuerst einen runden Deckzettel in die Kammer und übertragen Sie den durchsichtigen Schutz vorsichtig mit einem Pinsel.
Füllen Sie die Kammer mit 80% TDE-Lösung und fügen Sie dann zwei Standard-Abdeckschlitten sowie einen zweiten runden Abdeckschein und eine Silikondichtung hinzu. Schrauben Sie schließlich den Schraubring der Kammer an, um das System perfekt abzudichten. Nightsheet sowie Resonanzaufnahmen werden dank einer Software verarbeitet, die eine 3D-Nutzung und eine Analyse der gesamten Immunostain-Probe ermöglicht.
Eine solche Software ermöglicht es Ihnen, riesige Daten, die wir generieren, schnell zu öffnen, um einfach Schnappschüsse und Animationen zu erstellen. Es erlaubte, die Probe in einer anderen Ausrichtung zu bewegen und wir können 2D-Ansichten des Bildes dank eines 2D-Slicer-Werkzeugs in verschiedenen Ausrichtungen, X, Y und Y, Zed, zum Beispiel, generieren. Darüber hinaus ermöglicht eine solche Software die automatische Erkennung von Zentrosomen und primären Zilien, so dass die Anzahl der pathologischen Bedingungen im Vergleich zu Kontrollbedingungen quantifiziert werden kann.
Es ermöglicht auch die 3D-Rekonstitution von primären Zilien für eine präzise Messung der Standorte. Das von uns beschriebene Protokoll für die zellbasierte 2D-iPS-Modellierung neuer kortikaler Entwicklungen ermöglicht die Erzeugung neuronaler Rosettenstrukturen, die neue kortikale Vorläufer und Neuronen enthalten, die denen im sich entwickelnden Neokortex ähneln. Eine detaillierte Validierung kann durch konventionelle Immunfärbungsanalyse durchgeführt werden.
Anwendbare Vorläufer sollten bei uns doppelt gefärbt werden, um Empfindlichkeiten zu beeinflussen, während intermediäre Vorläufer durch TBI2-Färbung und frühe neokortikale Knochenneuronen durch CTIP2-positive Färbung aufgedeckt werden. Solche neuronalen rosettenartigen Strukturen modellieren die interkinetische Kernmigration radikaler Vorläufer, die durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen Phosphovimentin, die mototische Kerne färben, und TBX2, das die mitotische Spindel erhält, visualisiert werden können. Schließlich kann die Ziliagenese durch Immunfärbung mit Antikörpern analysiert werden, die gegen Perizentrik erhoben werden, die den Hinterkörper der primären Zilien färben und von bestimmten Mitteln sind, die das Axiom färben.
Auf einer solchen Rosettenstruktur werden primäre Zilien aus den apikalen Poly-Fabri-Kal-Vorläufern und dicht über dem zentralen Lumen jeder Ventrikulitregion extrahiert, während sie auch aus CTIP2-positiven Neuronen herausragen. Die Dissoziation von adenoneuralen Rosetten ermöglicht es, isolierte neurale Stamm- und Vorläuferzellkulturen zu erzeugen, die für die Analyse der primären Cilium-Biogenese und -Funktion sehr nützlich sind. Insbesondere beschreiben wir das Verfahren zum Testen der Induktion des Schallwegs nach der Behandlung mit empfohlenen Schallarzneimitteln oder Osmosinagonisten.
Nachfolgende RTPCR SA testet die Induktion von Sonika-Wirkstoff-Zielgenen wie GLI1 und PTCH1, und die Immunfluoreszenzanalyse testet die Dynamik der wichtigsten Schallarzneimittelkomponenten entlang des primären Ciliums, die dank Open-Source-Tools Ilastik und CiliaQ quantifiziert werden. Verschiedene Ziliarparameter, einschließlich Länge und Orientierung, werden untersucht, aber auch die Intensität der primären Ciliumkomponenten wird hier für GLI2 und GPR161 gezeigt, die das primäre Cilium als Reaktion auf die empfohlene sonika-medikamentöse Behandlung akkumulieren bzw. aus dem primären Cilium austreten. Das Protokoll, das wir für unsere 3D-iPS-zellbasierte Modellierung der neokortikalen Entwicklung detailliert beschreiben, ermöglicht die Erzeugung eines homogenen zerebralen Organoids mit dorsaler Vorderhirnidentität, das entweder durch konventionelle Immunstaining-Analyse oder durch Frauenfärbung, wie hier gezeigt, mit optimaler Penetration der Antikörper, wiederum N-Cadherin, PAX6 und CTIP2, die jeweils neuronales Cadherin färben, charakterisiert werden kann. in rosa, apikalen Vorläufern in der ventrikulären Zone wie Region, in grün und allen neugeborenen neokortikalen Neuronen, die sich in der kortikalen plattenartigen Region befinden.
Hier ist ein zweiter Film des gesamten Immunflecken-Organoids mit wieder erhöhten Antikörpern, CTIP2, in rot, möglicherweise in rosa gehalten, und TPX2, in grün, was es ermöglicht, mehrere Merkmale neokortikaler Vorläufer zu testen, wie z.B. interkinetische Kernmigration von Fabri-Kal-Vorläufern. Interessanterweise werden Phospho-Vimentin-positive Vorläufer auch in der supraventrikulären Zone beobachtet und beherbergen einen einzigartigen positiven Prozess, der sich bis zur positiven Oberfläche erstreckt, an äußere radiale gliale Vorläufer erinnert und die hohe Auflösung dieser Methode veranschaulicht. Hier ist ein Film eines immunstain, frei schwebenden Abschnitts, der dank eines Resonanz-Scanning-Mikroskops aufgenommen wurde und primäre Zilien zeigt, die mit Pericentrin-Antikörpern nachgewiesen wurden, die die Rückseite des Körpers grün gefärbt haben, und ARLT3B-Antikörper, die das Axiom in Rosa färben.
Primäre Zilien erstrecken sich von allen neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen, insbesondere an der epikalen Oberfläche der epikalen Vorläufer, aber auch in neokortikalen Neuronen der präplattenartigen Region. Schließlich rekapitulieren 2D-Neuronenrosetten und isolierte Stamm- und Vorläuferzellen mehrere Aspekte der zerebralen kortikalen Entwicklung und stellen komplementäre, nützliche Werkzeuge dar, um die Biogenese und Funktion des Ziliars zu testen. Das Protokoll, das wir hier nachweisen, ermöglichte es uns, aus diesen ausgeprägten iPS-Zelllinien erfolgreich dorsale Organoide des Vorderhirns zu erzeugen, die zu homogenen Ergebnissen führen und die Robustheit dieses Verfahrens gewährleisten.
Die Protokolle, die wir für die Immunfärbung, Das Clearing und die Bildgebung ganzer Organoide oder frei schwebender Abschnitte einrichten, sind einfach, schnell und kostengünstig. Die Kombination solcher zellbasierten Modelle und 3D-Bildgebungsanalysen an iPS-Zellen, die entweder durch Reprogrammierung von Ziliarstörungszellen oder durch die Verwendung der CRISPR 9-Technologie zur spezifischen Bearbeitung von Ziliargenen erzeugt werden, sollte signifikante Fortschritte beim Verständnis des Beitrags des primären Ciliums während der normalen und pathologischen Entwicklung der Großhirnrinde ermöglichen.
