الهدف العام من الإجراء الذي نوضحه هنا هو تشريح مشاركة السيلليوم الأولي أثناء تطور القشرة المخية الجديدة. وقد ثبت أن الأهداب الأولية حاسمة للعديد من خطوات تطور القشرة المخية الجديدة، بما في ذلك توسيع الخلايا السلفية، وتحديد المصير، فضلا عن هجرة الخلايا العصبية ونضجها. لمزيد من تشريح مشاركة الخلايا أثناء تطوير القشرة المخية الجديدة ، قمنا بإعداد الأدوات ذات الصلة من خلال الاستفادة من النماذج الناشئة القائمة على الخلايا 2D و 3D iPS لتطوير القشرة المخية الجديدة.
وبعبارة أخرى ، الورود العصبية والمواد العضوية الظهرية في الدماغ الأمامي. تبدأ النماذج القائمة على الخلايا 3D iPS بتكوين الجسم الجنيني. التصاق الأجسام الجنينية المذكورة ، يسمح بتوليد هياكل وردة عصبية 2D ، في حين أن الثقافة العائمة الحرة لمثل هذه EBs تسمح بتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية.
يعتمد البروتوكول الذي أنشأناه لتوليد المواد العضوية الدماغية على بروتوكولات منشورة سابقة باستخدام طريقة إسكات الصوت عن طريق إضافة عوامل ما قبل التنميط لتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية على وجه التحديد باستخدام مثبطات مسار أكتفين العقدي و BMP ، المعروف أيضا باسم تثبيط SMAD المزدوج. للاستفادة من تنظيم 3D من المواد العضوية ، قمنا بإعداد طريقة بسيطة وسريعة ، مما يسمح في وضع العلامات المناعية الكلية ، والمقاصة ، والحصول على الإضاءة من العضوية بأكملها بدقة عالية. وللتركيز على النشأة الحيوية الأولية للسيليوم ووظائفه ، قمنا بتكييف الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام عائمة حرة مقطوعة باهتزاز.
بعد تلطيخ المناعة وإزالة الأقسام ، حصلنا على الصور باستخدام المجهر البؤري للمسح الرنان. ابدأ بمزارع خلايا iPS التي تؤوي مستعمرات منتظمة كبيرة ، وتظهر تمايزا أقل من 10٪ ولا تتوافق مع 80٪. قم بتشريح كل مستعمرة خلية iPS يدويا باستخدام إبرة ، مما يسمح بالتقاط كل مستعمرة بدقة في الاتجاهين الأفقي والرأسي لإنشاء نمط رقعة الشطرنج ، وتقسيم كل مستعمرة إلى مجموعات متساوية.
افصل المستعمرة باستخدام مكشطة خلية وانقلها إلى لوحة مستنبتة منخفضة التعلق للغاية. دعهم يطوفون بين عشية وضحاها في الحاضنة حتى يتمكنوا من تكوين أجسام جنينية. في اليوم التالي ، قم بتدوير الوسط ، مع الحرص على عدم استنشاق الأجسام الجنينية ، ونقلها إلى أطباق مغلفة ب Poly-L-ornithine Laminine حتى يتم تكوين وريدات عصبية.
يستغرق ذلك حوالي 12 إلى 14 يوما. تحريض التحديث اليومي ، المتوسط ، والتحقق تحت المجهر لتشكيل هياكل وردة عصبية. من هذه الخطوة ، يمكن توسيع الورود العصبية وتمييزها ومعالجتها لتحليل التلطيخ المناعي أو فصلها للحصول على مزارع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا الخلقية المعزولة.
بادئ ذي بدء ، ابدأ بثقافات iPS التي تؤوي مستعمرات منتظمة كبيرة تظهر أقل من 10٪ من التمايز والتي تم تمريرها مرة واحدة تقريبا على الطبقة الأحادية. في اليوم صفر ، اسمح لخلية iPS بتكوين أجسام جنينية في وسط EB يحتوي على تركيز منخفض من fJ2 وتركيز عال من مثبطات ROCK المطلوبة لبقاء خلية hiiPS لتجنب إزعاج لوحات حاضنة تكوين EB لمدة ثلاثة أيام دون تغيير متوسط. في اليوم الثالث ، يجب أن تقيس EBs حوالي 400 ميكرومتر وتظهر حدودا منتظمة.
إذا كانت المعايير السابقة غنية لمعظم EBs ، فقم بتغيير الوسط باستخدام وسيط الحث الذي يحتوي على مثبطات SMAD مزدوجة بالتأكيد لتفتيح DBs contra من أفضل ستة إلى سبعة ، مما يشير إلى امتياز الطماطم العصبية. وهم يحولون DBs الأخرى إلى مقاييس غشاء قبو منخفضة العامل الإجمالي. من هذه الخطوة دائما استخدام مقص معقم للحصول على فتح الببتيدات لتجنب إتلاف المواد العضوية.
أولا نقل حوالي 15 المواد العضوية إلى أنبوب سريري. دع EB يستقر ويزيل الوسط عند 50 ميكرولتر من الوسط الحثي الثاني وينقل المواد العضوية إلى أنبوب حساس للميكرو يحتوي على 100 ميكرولتر من المصفوفة ومتجانسة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. انشر الخليط على وسط بئر من لوحة مرفقة محايدة.
وأخيرا ، EBs الفضاء بحيث لا تلمس بعضها البعض لتجنب اندماجها. دع المادة تتصلب في الحاضنة لمدة 45 دقيقة ، أضف وسط الحث اثنين إلى كل بئر واحتضنها في الحاضنة. تحديث الحث المتوسط اثنين كل يومين.
في اليوم 17 ، افصل مصفوفة الغشاء السفلي يدويا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصات سعة خمسة مل. احتضان الصفيحة العضوية في وسط الترجمة تحت التحريض لتحسين الامتصاص الغذائي. الأهم من ذلك ، استخدم حاضنة مختلفة للثقافة الثابتة والثقافة على الاهتزاز المداري لتجنب أي اهتزازات ضارة بنمو خلايا iPS الملتصقة.
بعد التثبيت ، يستغرق التخلل والحجب والحضانة بالأجسام المضادة الأولية والثانوية 10 أيام ، بما في ذلك خطوات الغسيل. تعتمد طريقة المقاصة التي نفضلها على TDE ، وهو مشتق من الجليكول. للحصول على إزالة مثالية ، قم بتنبيب العضوي في محلول TDE مع زيادة التركيز تدريجيا لمدة 24 ساعة لكل منهما.
بالنسبة للتضمين العضوي ، استخدم نظام الصب الرئيسي المخصص المصنوع من حقنة مل واحدة ، والتي يتم قطع الطرف باستخدام مشرط. يوصى باستخدام درجة انصهار Agarose المنخفضة ، حيث تبلغ درجة حرارة انصهاره حوالي 60 درجة مئوية فقط. تحضير 4٪ منخفضة ذوبان Agarose في محلول TDE 60٪ والسماح لها لتبرد فقط حوالي 37 درجة مئوية في قاعدة مائية قبل تضمين العضوية.
ضع في المحقنة 600 ميكرولتر من محلول الجل باستخدام المكبس ، ثم ضع العينة واملأ المحقنة ب 400 ميكرولتر من محلول الجل. دع الجل يتبلمر ، وأخيرا ، يتم تركيب العينة بشكل مثالي داخل الجل ويمكن دفعها بسهولة داخل الغرفة المضاءة لوضع العضو العضوي أمام الهدف. يعد الفحص المجهري الفلوري المضيء مثاليا للتصوير الأول لمثل هذا العضوي الواضح.
لقد خفضنا التصوير الفوتوغرافي ووزننا الدقة دون الخلوية. هنا ، استخدمنا هدفا 20x مغمورا في محلول TDE بنسبة 80٪ تمت إضافته في غرفة العينة للسماح بالتكيف بدقة مع معامل الانكسار لطريقة المقاصة الخاصة بنا. تم تصميم أكبر طلب عينة لاستيعاب حقنة سعة ملليلتر واحد يمكن إدخالها من الأعلى باستخدام المكبس الذي يمكن تشغيله بمجرد تركيب أمر العينة لوضع العضو أمام الهدف.
يستغرق الحصول على عضوي كامل حوالي 5 إلى 10 دقائق. للتلطيخ المناعي على الأقسام العائمة بحرية ، قم بجمع وإصلاح المواد العضوية الخاصة بك في جزء من أربعة أشخاص بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. قم بتضمين المواد العضوية في Agarose منخفض الذوبان بنسبة 4٪ ومقطع باستخدام اهتزاز للحصول على 150 ميكرومتر من ستة أقسام تم نقلها في محلول PBS ، باستخدام فرشاة طلاء لتجنب إتلافها.
بعد التخلل والحجب ، احتضن الأقسام العائمة بحرية بالأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية وتحت الإثارة. اغسل الأقسام بعناية قبل الحضانة بالأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وتحت الإثارة. أخيرا ، للحصول على التطهير الأمثل ، احتضن القسم في محلول TDE مع زيادة التركيز تدريجيا لمدة ساعة واحدة و 30 في 60٪ TDE ثم في 80٪ TDE بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
قم بتخزين القسم في محلول TDE و TLAC بنسبة 80٪ عند أربع درجات مئوية. قم بتركيب قسم عائم حر في غرفة خلية ، سعيا للحفاظ على العينة في محلول TDE بنسبة 80٪ ومصمم للتكيف مع مرحلة آلية من المجاهر السريرية. أولا ، ضع زلة غطاء مستديرة واحدة في الغرفة وانقل بعناية الحماية الواضحة باستخدام فرشاة الطلاء.
املأ الغرفة بمحلول TDE بنسبة 80٪ ثم أضف زلتين قياسيتين للغطاء بالإضافة إلى قسيمة غطاء دائرية ثانية وختم سيليكون. أخيرا ، المسمار على حلقة الشد في الغرفة لإغلاق النظام تماما. تتم معالجة Nightsheet ، وكذلك عمليات الاستحواذ على الرنين بفضل برنامج يتيح استخدام 3D وتحليل عينة المناعة بأكملها.
يتيح لك هذا البرنامج فتح البيانات الضخمة التي نولدها بسرعة لإنشاء لقطات ورسوم متحركة بسهولة. سمح بنقل العينة في اتجاه مختلف ويمكننا إنشاء طرق عرض 2D للصورة بفضل أداة مقسمات طرق العرض 2D في اتجاه مختلف ، X و Y و Y و Zed ، على سبيل المثال. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا البرنامج بالكشف التلقائي عن كل من الأهداب المركزية والأولية ، مما يتيح تحديد العدد في الظروف المرضية مقابل ظروف التحكم.
كما يسمح بإعادة تشكيل 3D من الأهداب الأولية لقياس دقيق للمواقع. البروتوكول الذي وصفناه للنمذجة القائمة على الخلايا 2D iPS للتطور القشري الجديد يسمح بتوليد هياكل وردة عصبية تحتوي على أسلاف قشرية جديدة وخلايا عصبية مماثلة لتلك التي شوهدت في القشرة المخية الجديدة النامية. يمكن إجراء التحقق التفصيلي من خلال تحليل التلطيخ المناعي التقليدي.
يجب أن تكون السلف القابلة للتطبيق مزدوجة التلطيخ معنا للتأثير على الحساسيات بينما يتم الكشف عن السلف الوسيطة عن طريق تلطيخ TBI2 والخلايا العصبية القشرية الجديدة المبكرة للعظام عن طريق تلطيخ CTIP2 الإيجابي. مثل هذه الهياكل العصبية الشبيهة بالوردة نموذج للهجرة النووية الحركية للأسلاف الجذريين الذين يمكن تصورهم عن طريق تلطيخ المناعة بالأجسام المضادة المرفوعة ضد الفوسفو فيمنتين الذي يلطخ النوى المتحركة و TBX2 التي تحافظ على المغزل الانقسامي. أخيرا ، يمكن تحليل الأهداب عن طريق تلطيخ المناعة بالأجسام المضادة المرفوعة ضد حول المركز ، والتي تلطخ الجسم الخلفي للأهداب الأولية وهي ذات وسائل معينة تلطخ البديهية.
على مثل هذا الهيكل الوردي ، يتم استخراج الأهداب الأولية من أسلاف بولي فابري-كال القمي وبكثافة فوق التجويف المركزي لكل منطقة بطينية بينما تكون بارزة أيضا من الخلايا العصبية الإيجابية CTIP2. يسمح تفكك الورود الغدية بتوليد مزارع الخلايا الجذعية العصبية والسلفية المعزولة التي تكون مفيدة للغاية لتحليل النشأة الحيوية الأولية للسيليوم ووظيفتها. على وجه الخصوص ، نقوم بتفصيل الإجراء لاختبار تحريض مسار الدواء الصوتي بعد العلاج باستخدام الأدوية الصوتية الموصى بها أو ناهضات الأوزموسين.
يختبر RTPCR SA اللاحق تحريض الجينات المستهدفة لدواء سونيكا ، مثل GLI1 و PTCH1 ، ويختبر تحليل التألق المناعي ديناميكيات مكونات الأدوية الصوتية الرئيسية على طول السيليوم الأساسي الذي يتم تحديده كميا ، وذلك بفضل أدوات مفتوحة المصدر ، ilastik و CiliaQ. يتم التحقيق في المعلمات الهدبية المختلفة ، بما في ذلك الطول والاتجاه ، ولكن أيضا كثافة مكونات السيليوم الأولية تظهر هنا ل GLI2 و GPR161 التي ، على التوالي ، تتأقلم أو تخرج من السيبيوم الأولي استجابة للعلاج الدوائي سونيكا الموصى به. البروتوكول الذي نفصله للنمذجة القائمة على الخلايا 3D iPS لتطور القشرة المخية الجديدة يسمح بتوليد عضوي دماغي متجانس مع هوية الدماغ الأمامي الظهرية التي يمكن أن تتميز إما بتحليل المناعة التقليدي أو عن طريق تلطيخ المرأة ، كما هو موضح هنا ، مع الاختراق الأمثل للأجسام المضادة المرفوعة ، مرة أخرى ، N-cadherin ، PAX6 ، و CTIP2 التي تلطخ على التوالي كادرين الخلايا العصبية ، في الأسلاف الوردي والقمي في المنطقة البطينية مثل المنطقة ، باللون الأخضر ، وجميع الخلايا العصبية القشرية الحديثة حديثي الولادة ، الموجودة في الصفيحة القشرية مثل المنطقة.
فيما يلي فيلم ثان للعضوي المناعي بأكمله مع الأجسام المضادة التي تم رفعها مرة أخرى ، CTIP2 ، باللون الأحمر ، وربما يتم الاحتفاظ بها باللون الوردي ، و TPX2 ، باللون الأخضر ، مما يسمح باختبار العديد من خصائص أسلاف القشرة المخية الجديدة ، مثل الهجرة النووية بين الحركية لأسلاف Fabri-Kal. ومن المثير للاهتمام ، أن السلف الإيجابي للفوسفو فيمنتين لوحظ أيضا في المنطقة فوق البطينية مثل المنطقة ويؤوي عملية إيجابية فريدة تمتد إلى السطح الإيجابي ، تذكرنا بالأسلاف الدبقية الشعاعية الخارجية وتوضح الدقة العالية لهذه الطريقة. في ما يلي فيلم لقسم مناعي عائم حر ، تم الحصول عليه بفضل مجهر مسح الرنين يظهر الأهداب الأولية المكتشفة بالأجسام المضادة حول المركز التي تلطخ الجزء الخلفي من الجسم ، باللون الأخضر ، والأجسام المضادة ARLT3B التي تلطخ البديهية ، باللون الوردي.
تمتد الأهداب الأولية من جميع الخلايا الجذعية والسلفية العصبية ، على وجه الخصوص ، على السطح الملحمي للأسلاف الملحميين ولكن أيضا في الخلايا العصبية القشرية الجديدة في المنطقة الشبيهة بالصفيحة السابقة. أخيرا ، تلخص وريدات الخلايا العصبية 2D والخلايا الجذعية والسلفية المعزولة العديد من جوانب التطور القشري الدماغي وتمثل أدوات تكميلية ومفيدة لاختبار التكوين الحيوي الهدبي والوظيفة. سمح لنا البروتوكول الذي نكتشفه هنا بتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهري بنجاح من خطوط خلايا iPS المميزة هذه التي تؤدي إلى نتائج متجانسة ، مما يضمن متانة هذا الإجراء.
البروتوكولات التي وضعناها للتلطيخ المناعي وإزالة وتصوير المواد العضوية بأكملها أو الأقسام العائمة الحرة بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. إن الجمع بين هذه النماذج القائمة على الخلايا وتحليل التصوير ثلاثي الأبعاد على خلايا iPS ، التي يتم إنشاؤها إما عن طريق إعادة برمجة خلايا الاضطراب الهدبي أو باستخدام تقنية CRISPR 9 لتحرير الجينات الهدبية على وجه التحديد ، يجب أن يسمح بتقدم كبير في فهم مساهمة السيبيوم الأولي أثناء التطور الطبيعي والمرضي للقشرة الدماغية.
