L’objectif global de la procédure que nous détaillons ici est de disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical. Les cils primaires se sont révélés cruciaux pour de nombreuses étapes du développement néocortical, y compris l’expansion des cellules progénitrices, la détermination du destin, ainsi que la migration et la maturation neuronales. Pour disséquer davantage l’implication cellulaire au cours du développement néocortical, nous avons mis en place des outils pertinents en tirant parti des modèles cellulaires iPS 2D et 3D émergents du développement néocortical.
En d’autres termes, les rosettes neurales et les organoïdes du cerveau antérieur dorsal. Les modèles 3D basés sur les cellules iPS commencent par la formation du corps embryoïde. L’adhésion desdits corps embryonnaires permet la génération de structures de rosettes neurales 2D, tandis que la culture flottante libre de ces EB permet la génération d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal.
Le protocole que nous avons mis en place pour générer des organoïdes cérébraux est basé sur des protocoles publiés précédemment en utilisant la méthode du bâillonnement en ajoutant des facteurs de pré-modelage pour générer spécifiquement des organoïdes du cerveau antérieur dorsal en utilisant des inhibiteurs de la voie nodale et BMP de l’activine, également connue sous le nom d’inhibition double SMAD. Pour tirer parti de l’organisation 3D des organoïdes, nous avons mis en place une méthode simple et rapide, permettant l’immunomarquage total, le nettoyage et l’acquisition éclairée de l’ensemble de l’organoïde à haute résolution. Et pour se concentrer sur la biogenèse et les fonctions primaires du cilium, nous avons adapté l’immunohistochimie sur des sections flottantes coupées avec un vibratome.
Après l’immunocoloration et le nettoyage des sections, nous avons acquis les images en utilisant la microscopie confocale à balayage résonant. Commencez par des cultures cellulaires iPS abritant de grandes colonies régulières, présentant moins de 10% de différenciation et ne sont pas conformes à plus de 80%. Disséquez manuellement chaque colonie de cellules iPS à l’aide d’une aiguille, ce qui permet d’attraper précisément chaque colonie dans des directions horizontales et verticales pour créer un motif en damier, divisant chaque colonie en grappes égales.
Détachez la colonie à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférez-les sur une plaque de culture à fixation ultra faible. Laissez-les flotter pendant la nuit dans l’incubateur afin qu’ils puissent former des corps embryoïdes. Le lendemain, tournez le milieu, en prenant soin de ne pas aspirer les corps embryonnaires, et transférez-les dans des plats enrobés de poly-L-ornithine Laminine jusqu’à la formation de rosettes neurales.
Cela prend environ 12 à 14 jours. Induction de rafraîchissement quotidien, milieu et vérification au microscope de la formation de structures de rosettes neurales. À partir de cette étape, les rosettes neurales peuvent être étendues, différenciées et traitées pour une analyse immunocolorante ou dissociées pour obtenir des cultures isolées de cellules souches neurales et progénitales.
Tout d’abord, commencez par les cultures iPS abritant de grandes colonies régulières présentant moins de 10% de différenciation et qui ont été passées presque une fois sur la monocouche. Le jour zéro, permettre aux cellules iPS de former des corps embryoïdes dans un milieu EB contenant une faible concentration de fJ2 et une concentration élevée d’inhibiteur de ROCK nécessaire à la survie des cellules hiiPS afin d’éviter de perturber les plaques d’incubateur de formation EB pendant trois jours sans changement de milieu. Le troisième jour, les EB devraient mesurer environ 400 micromètres et afficher des bordures régulières.
Si les critères passés sont riches pour la plupart des EB, changez le milieu avec le milieu d’induction un contenant deux inhibiteurs de SMAD certainement pour égayer les contre-DB de mieux six à sept, indiquant une concession de tomaly neurale. Et ils transforment d’autres DB en mesures de membrane basale à facteur brut réduit. À partir de cette étape, utilisez toujours des ciseaux stériles pour obtenir l’ouverture des peptides afin d’éviter d’endommager les organoïdes.
Transférez d’abord environ 15 organoïdes dans un tube clinique. Laissez l’EB se déposer et retirer le milieu à 50 microlitres du milieu d’induction deux et transférer les organoïdes dans un tube microsensible contenant 100 microlitres de matrice et homogénéisé par pipetage de haut en bas. Étaler le mélange sur le centre d’un puits d’une plaque de fixation neutre.
Et enfin, espacez les EB pour qu’ils ne se touchent pas pour éviter qu’ils ne fusionnent. Laissez la matière se solidifier dans l’incubateur pendant 45 minutes, ajoutez le milieu d’induction deux à chaque puits et incubez dans l’incubateur. Rafraîchissez le milieu d’induction deux tous les deux jours.
Le jour 17, dissociez manuellement la matrice de la membrane basale en pipetant de haut en bas 10 fois avec des pipettes de cinq ml. Incuber la plaque organoïde dans le milieu de translation sous agitation pour améliorer l’absorption nutritionnelle. Il est important de noter qu’utilisez un incubateur différent pour la culture stationnaire et la culture sur agitateur orbital afin d’éviter toute vibration préjudiciable à la croissance des cellules iPS adhérentes.
Après la fixation, la perméabilisation, le blocage et l’incubation avec des anticorps primaires et secondaires prennent 10 jours, y compris les étapes de lavage. La méthode de compensation que nous avons privilégiée repose sur le TDE, un dérivé du glycol. Pour une élimination optimale, intuber l’organoïde dans une solution de TDE avec une concentration progressivement augmentée pendant 24 heures chacun.
Pour l’incorporation d’organoïdes, utilisez un système de moulage principal personnalisé fabriqué à partir de la seringue d’un ml, dont la pointe est coupée à l’aide d’un scalpel. L’agarose à faible point de fusion est recommandée, car sa température de fusion n’est que d’environ 60 degrés Celsius. Préparez de l’agarose à faible teneur en fusion à 4% dans une solution de TDE à 60% et laissez-la refroidir à environ 37 degrés Celsius dans une incorporation pré-organoïde à base d’eau.
Mettez dans la seringue 600 microlitres de la solution de gel à l’aide du piston, puis positionnez l’échantillon et remplissez la seringue avec 400 microlitres de la solution de gel. Laissez le gel polymériser, et enfin, l’échantillon est monté idéalement dans le gel et peut être facilement poussé dans la chambre éclairée pour positionner l’organoïde devant l’objectif. La microscopie à fluorescence éclairée est idéale pour la première imagerie d’un tel organoïde clair.
Nous avons réduit l’imagerie photo et pesé la résolution subcellulaire. Ici, nous avons utilisé un objectif 20x immergé dans une solution 80% TDE ajoutée dans la chambre d’échantillonnage pour permettre de s’ajuster avec précision à l’indice de réfraction de notre méthode de compensation. La plus grande commande d’échantillons a été conçue pour accueillir une seringue d’un millilitre qui peut être insérée par le haut avec le piston qui peut être utilisé une fois que l’ordre d’échantillon est monté pour positionner l’organoïde devant l’objectif.
L’acquisition d’un organoïde entier prend environ 5 à 10 minutes. Pour la coloration immunologique sur les sections flottantes, collectez et fixez vos organoïdes dans une partie à quatre personnes pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Incorporer les organoïdes dans 4% d’agarose et de section à faible fusion en utilisant un vibratome pour obtenir 150 micromètres de six sections transférées dans une solution de PBS, à l’aide d’un pinceau pour éviter de les endommager.
Après perméabilisation et blocage, incuber les sections flottantes avec un anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius et sous agitation. Lavez soigneusement les sections avant l’incubation avec un anticorps secondaire pendant deux heures à température ambiante et sous agitation. Enfin, pour un nettoyage optimal, incuber la section dans une solution de TDE avec une concentration progressivement augmentée pendant une heure et 30 dans 60% TDE puis dans 80% TDE pendant la nuit à température ambiante.
Conservez la section dans une solution à 80 % de TDE et de TLAC à quatre degrés Celsius. Montez une section flottante dans une chambre cellulaire, en s’efforçant de maintenir l’échantillon en solution TDE à 80% et conçu pour s’adapter à un stade motorisé de microscopes cliniques. Tout d’abord, mettez un couvercle rond dans la chambre et transférez soigneusement la protection claire à l’aide d’un pinceau.
Remplissez la chambre avec une solution TDE à 80 %, puis ajoutez deux bordereaux de couvercle standard plus un deuxième bordereau de couvercle rond et un joint en silicone. Enfin, vissez la bague de vissage de la chambre pour sceller parfaitement le système. Nightsheet, ainsi que les acquisitions de résonance sont traitées grâce à un logiciel permettant une utilisation 3D et une analyse de l’ensemble de l’échantillon immunotaché.
Un tel logiciel vous permet d’ouvrir rapidement d’énormes données que nous générons pour faire facilement des instantanés et des animations. Il a permis de déplacer l’échantillon dans différentes orientations et nous pouvons générer des vues 2D de l’image grâce à un outil de découpe 2D dans différentes orientations, X, Y et Y, Zed, par exemple. En outre, un tel logiciel permet la détection automatique des centrosomes et des cils primaires, ce qui permet de quantifier le nombre dans des conditions pathologiques par rapport aux conditions de contrôle.
Il permet également une reconstitution 3D des cils primaires pour une mesure précise des sites. Le protocole que nous avons décrit pour la modélisation cellulaire 2D iPS du nouveau développement cortical permet la génération de structures de rosette neurale contenant de nouveaux progéniteurs corticaux et neurones similaires à ceux observés dans le néocortex en développement. Une validation détaillée peut être effectuée par une analyse immunocolorante conventionnelle.
Les progéniteurs applicables doivent être doublement colorés avec nous pour avoir un impact sur les sensibilités, tandis que les progéniteurs intermédiaires sont révélés par la coloration TBI2 et les neurones néocorticaux osseux précoces par la coloration positive CTIP2. De telles structures en forme de rosette neurale modélisent la migration nucléaire intercinétique des progéniteurs radicaux qui peuvent être visualisés par immunocoloration avec des anticorps élevés contre la phospho vimentine qui colorent les noyaux mototiques et TBX2 qui soutient le fuseau mitotique. Enfin, la cilénèse peut être analysée par immunocoloration avec des anticorps élevés contre le péricentrique, qui tachent le corps arrière des cils primaires et sont de certains moyens qui tachent l’axiome.
Sur une telle structure de rosette, les cils primaires sont extraits des progéniteurs poly fabri-Kal apicals et densément au-dessus de la lumière centrale de chaque région de ventriculite alors qu’ils dépassent également des neurones positifs CTIP2. La dissociation des rosettes adénoneurales permet de générer des cultures isolées de cellules souches neurales et progénitrices qui sont très utiles pour analyser la biogenèse et la fonction du cilium primaire. En particulier, nous détaillons la procédure pour tester l’induction de la voie du médicament sonique après le traitement avec le médicament sonique recommandé ou les agonistes de l’osmosine.
RtPCR SA teste ensuite l’induction de gènes cibles de médicaments sonica, tels que GLI1 et PTCH1, et l’analyse d’immunofluorescence teste la dynamique des composants clés du médicament sonique le long du cil primaire qui sont quantifiés, grâce à des outils open source, ilastik et CiliaQ. Différents paramètres ciliaires, y compris la longueur et l’orientation, sont étudiés, mais aussi l’intensité des composants primaires du cilium sont montrés ici pour GLI2 et GPR161 qui, respectivement, accumuulate ou sortent du cilium primaire en réponse au traitement médicamenteux sonica recommandé. Le protocole que nous détaillons pour la modélisation cellulaire 3D iPS du développement néocortical permet la génération d’organoïdes cérébraux homogènes avec une identité dorsale du cerveau antérieur qui peut être caractérisée soit par une analyse immunocolorante conventionnelle, soit par une coloration de la femme, comme indiqué ici, avec une pénétration optimale des anticorps élevés, encore une fois, N-cadhérine, PAX6 et CTIP2 qui colorent respectivement la cadhérine neuronale, en rose, les progéniteurs apicals dans la région de la zone ventriculaire, en vert, et tous les neurones néocorticaux nouveau-nés, situés dans la région de la plaque corticale.
Voici un deuxième film de l’ensemble de l’organoïde immunocolore avec des anticorps relevés à nouveau, CTIP2, en rouge, éventuellement maintenu en rose, et TPX2, en vert, permettant de tester plusieurs caractéristiques des progéniteurs néocorticaux, tels que la migration nucléaire intercinétique des progéniteurs Fabri-Kal. Fait intéressant, des progéniteurs positifs à la phospho vimentine sont également observés dans la région de la zone supraventriculaire et abritent un processus positif unique s’étendant jusqu’à la surface positive, rappelant les progéniteurs gliaux radiaux externes et illustrant la haute résolution de cette méthode. Voici un film d’une section immunocolore, flottant librement, acquise grâce à un microscope à balayage par résonance montrant des cils primaires détectés avec un anticorps péricentrine qui a taché l’arrière du corps, en vert, et des anticorps ARLT3B qui colorent l’axiome, en rose.
Les cils primaires s’étendent de toutes les cellules souches neuronales et progénitrices, en particulier à la surface épicale des progéniteurs épicuriens, mais aussi dans les neurones néocorticaux de la région de type pré-plaque. Enfin, les rosettes de neurones 2D et les cellules souches et progénitrices isolées récapitulent plusieurs aspects du développement cortical cérébral et représentent des outils complémentaires et utiles pour tester la biogenèse et la fonction ciliaires. Le protocole que nous détectons ici nous a permis de générer avec succès des organoïdes dorsaux du cerveau antérieur à partir de ces lignées cellulaires iPS distinctes qui donnent lieu à des résultats homogènes, assurant la robustesse de cette procédure.
Les protocoles que nous avons mis en place pour l’immunocoloration, le nettoyage et l’imagerie d’organoïdes entiers ou de sections flottantes sont simples, rapides et rentables. La combinaison de tels modèles cellulaires et de l’analyse d’imagerie 3D sur des cellules iPS, générées soit par la reprogrammation de cellules de perturbation ciliaire, soit par l’utilisation de la technologie CRISPR 9 pour éditer spécifiquement les gènes ciliaires, devrait permettre des progrès significatifs dans la compréhension de la contribution du cilium primaire au cours du développement normal et pathologique du cortex cérébral.
