We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education&#160;Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.

1. Dissection של Ovarioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כרבע זבובים נקבת 2-4 יום בן וכמה גברים לבקבוקון מזון טרי זבוב עם שמרים יבשים פעילים הוסיפו. השתמש כותנה כתוספת לבקבוקונים, ולהוסיף כמה טיפות של מים לכותנה כדי לשמור על לחות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון מקום בחממה C ° 25 ל14-16 שעות כדי למקסם את מספר שלב 8-10 תאי ביצה. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לטמפרטורה ושלב רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת לנתיחה, פתרונות 0.1M KPO 4 וNP40 כנדרש ליום המחרת (ראו חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים באמצעות CO 2, ומניח תחת מיקרוסקופ לנתיחה. Pipet כמה טיפות של תקשורת לנתיחה לכל חלל בשקופית זכוכית הדיכאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק מלקחיים בכל יד בכ 30 מעלות זווית לראש הטבלה ולהתמצא זבוב נקבה אחת עם הכנפיים כלפי מטה. עם היד הלא הדומיננטית שלך, להרים את הנקבה באמצעות מלקחיים, האחיזה בnterior של הבטן, ליד בית החזה, ולהטביע אותה לתקשורת לנתיחה בשקופית הדיכאון (הבלעה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מלקחיים האחר, לתפוס את השלד החיצוני באחורית הגחון של הבטן ולחדור מבעד. תפוס את השחלות בקצה האחורי, ואז למשוך אותם אל מחוץ לבטן ומניח לתקשורת טרי בצד השני של שקופית הדיכאון האחר. (הבלעה איור 1 א). הימנע קרע לגזרים את המעיים. מחק את הפגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם זבובי נקבה האחרים עד שכל השחלות הם גזורים. מחק את הזכרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים, להחזיק השחלה בסוף האחורי (סמוך לתאי הביצה הגדולים ביותר), ועם היד השנייה להשתמש זוג המלקחיים לצבוט אחד מהתאים קדמי ביותר הביצה (germarium). (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט ובהתמדה, למשוך שרשרת ovariole מתוך מעטפת השחלה. תמשיך לנתח את ovarioles בנפרד עד שכל תאי הביצה הרצויות הם removed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.7-1.8 לכל השחלות גזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת פעולה, להעביר ovarioles לצינור 0.6ml בעזרת פיפטה העברה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו ovarioles ליישב לתחתית של צינור, ולאחר מכן להמשיך לשלבים תיקון וצביעה. </li></ol> 2. Immunofluorescent (IF) הכתמה של Ovarioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את התקשורת לנתיחה מovarioles עם טפטפת. הקפד שלא להסיר את כל ovarioles או תאי ביצה. השאר כ -50 μl של ovarioles ותקשורת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של paraformaldehyde 16% ל -150 μl של 0.1 מ &#39;4 מאגר KPO בצינור, ולהוסיף פתרון לתאי ביצה כדי לתקן אותם. דגירה בעוד נדנדה במשך 10 דקות. זהירות: paraformaldehyde הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשטוף פעמיים עם חיץ לשטוף NP40 0.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים במשך 15 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין סטנדרטי IF פרוטוקול 15 לשלבים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לאחר קיבוע, להוסיףנוגדנים עיקריים בדילולים המתאימים דגירה O / N ב 4 ° C. לשטוף מספר פעמים בNP40, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משני (1: 200 דילולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מספר פעמים בNP40, ולאחר מכן להוסיף DAPI (1: 1000) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לחזור שוטף. פעם אחת אם הפרוטוקול הוא מלא, להוסיף 200 μl של גליצרול 50% ב- PBS לתאי ביצה ותן לו לשבת בRT עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון, להחליף אותו עם גליצרול 70% ב- PBS, ומכסה בנייר כסף. הנח מדגם ב 4 ᵒC עד מוכן להרכבה. בינתיים, תמשיך עם שלב 3. </li></ol></li></ol> 3. Advance הכנת שקופיות ג&#39;לי גליצרין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד לפחות 4 מיליליטר של גליצרין ריבה בעזרת מרית ולמלא צינור תרבות תא זכוכית לסימן חצי הדרך. להמס ריבת גליצרין באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים טיפה קטנה של גליצרול, כ -300 μl, מפתרון המניות על שתי שקופיות מיקרוסקופ. שימוש ברקמה, להפיץ גליצרול בla דקYer פני כל אחת מהשקופיות. זה מספק בסיס ומאפשר להסרת קלה של ג&#39;לי גליצרין בשלב 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקצה של קצה פיפטה 1,000 μl מסונן. קצה פיפטה לחתוך שימוש להעברת 1,000-1,500 μl של ג&#39;לי גליצרין החם לאט לכל שקופית מיקרוסקופ. לטפל כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות ג&#39;לי גליצרין לשבת במשך 5 דקות בRT להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל שקופית ג&#39;לי גליצרין ב 60 מ&quot;מ × 15 מ&quot;מ צלחת פטרי ולכסות בניילון הנצמד. מקום 4 ° CO / N. לחלופין, חנות גליצרין שקופיות ריבה עד 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הרכבה צ&#39;יימברס הביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגימות מהשלב 2.5, טיפות 3 μl כמה פיפטה של ​​תאי ביצה בגליצרול 70% על פני שקופית ג&#39;לי גליצרין אחד. המשך pipetting 3 טיפות μl עד שכל תאי הביצה בשקופית זו. ודא שכל טיפה מכילה לפחות עשרה תאי ביצה. בינתיים, מחמם צינור תרבות של ג&#39;לי גליצרין באמבט המים C ° 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף ג&#39;לי גליצרין עם תאי ביצה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. התאם הגדלה, כך שרק טיפה אחת של תאי ביצה היא בשדה הראייה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 30 מד ככפית, להרים את תא ביצת שלב הרצוי. כאשר תאים נחוצים, נפרדים רצויים ביצה משרשרת ovariole באמצעות המחט כסכין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מפסולת שעלול להפריע להדמיה, להעביר את תא הביצה לשקופית ג&#39;לי גליצרין השני, עם הקדמי פונה שמאלה (איור 1E -1). חזור על פעולה עד שיש לפחות שבעה תאי ביצה בשורה בטור (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופס עמודות חדשות של שבע עד שכל תאי הביצה הרצויות מועברים לשקופית ג&#39;לי גליצרין השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתלוש פיסה קטנה של רקמה ושזירה. להשתמש בזה כדי לספוג את PBS-גליצרול העודף מתאי הביצה על ידי נוגע בקלילות כל אחד. יש להיזהר שלא להסיר את תאי ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנותקקצה קצה פיפטה 200 μl מסונן. להשתמש בזה כדי להעביר 150 μl של גליצרין ג&#39;לי כדי לכסות את כל העמודות של תאי ביצה. הערה: כמות ריבת גליצרין הדרושה כדי לכסות את העמודות מבוססת על שלבי תא ביצה ומספר העמודות. הסכום עשוי להיות מותאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תאי ביצה רכובים לשבת במשך 5 דקות ב RT עד השכבה העליונה של ג&#39;לי גליצרין הוא התגבש לגמרי (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית מקום תאי ביצה רכובים בצלחת פטרי מ&quot;מ 60 מ&quot;מ × 15 ומכסים בניילון נצמד. חנות ב 4 ° CO / N כדי לאפשר את שכבות ריבת גליצרין כדי לחזק יחד (מקום בחושך, אם קיים חשש לגבי photobleaching). </li></ol> 5. הכנת לשכות ביצת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות של תאי ביצה רכובים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. התאם הגדלה, כך שרק אחד עמודה של תאי ביצה היא בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל זעיר 45 ° זווית, לחתוך straigקו ht בצדו הימני של העמוד הראשון של תאי ביצה (קרובים לצד האחורי של תאי הביצה). (איור 1D-E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לחתוך מעל תא הביצה הראשון בחלק העליון ומתחת לתא הביצה האחרון בטור. בשלב זה הטור של תאי ביצה יש לחתוך משלושה צדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microknife, הפרוסה בצדו השמאלי של העמוד, קרוב ככל האפשר לצד הקדמי של תאי הביצה (איור 1E -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​קר 1X PBT 100 μl על העמודה לחתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במרית קצוות עגול כדי להסיר את ג&#39;לי גליצרין העודף סביב שלושה צדדים של טור החתך של תאי ביצה וזורקים, והשאיר את שאר בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המרית בחתך שנעשה בצד הקדמי של תאי ביצה ולהפריד את העמודה מגוש ג&#39;לי גליצרין העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות מיקרוסקופית לאו הפוך (5.8.1) או זקוף (5.8.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך מיקרוסקופים: העברה tהוא הטור של תאי ביצה לcoverslip עם הצד קדמי של תאי ביצה פונה כלפי מטה. חזור על שלבים 5.2-5.8 עד שכל העמודות של ג&#39;לי גליצרין הוסרו ורכובה. הוסף כמה טיפות של 50% PBS-גליצרול על כל בלוק של תאי ביצה כדי למנוע מהם מהתייבשות. תאי ביצת תמונה ישירות על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופ הזקוף: העבר את העמודה של תאי ביצה לשקופית מיקרוסקופ עם הצד הקדמי פונה כלפי מעלה. חזור על שלבים 5.2-5.9 עד שכל העמודות של ג&#39;לי גליצרין הוסרו ורכובות על שקופיות מיקרוסקופ. הוסף כמה טיפות של 50% PBS-גליצרול על כל בלוק של תאי ביצה וחוסם כיסוי עם coverslip ½ # 1. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+follicle+cells:+morphogenesis+in+an+eggshell.">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li><li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+morphogenetic+repertoire:+perspectives+from+the+Drosophila+egg.">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li><li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+choreography:+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells.">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border-cell+migration:+the+race+is+on.">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li><li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+JAK/STAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila.">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li><li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis.">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li><li>Denef, N., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning:+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium.">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li><li>Beccari, S., Teixeira, L., R&#248;rth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis.">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li><li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=slow+border+cells,+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis,+encodes+Drosophila+C/EBP.">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li><li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium.">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li><li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells.">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li><li>Van de Bor, V., Zimniak, G., C&#233;r&#233;zo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK/STAT+activation+during+cell+invasiveness.">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li><li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypicans+regulate+JAK/STAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen.">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li><li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells.">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li><li>R&#248;rth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila).">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li><li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis.">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li><li>Qui&#241;ones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li><li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upright+imaging+of+Drosophila+embryos.">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

כאן אנו מתארים שיטה להר ותמונה קטנה, פיתוח תאי ביצה מנקודת מבט סוף-על. טכניקות נפוצות לתאי ביצת הדמיה מותאמות להשקפות לרוחב ובעיקר לאפשר להדמיה מדויקת של תאי זקיק Medio-צדדי כאשר מוכתם עם נוגדני ניאון. השימוש בZ- ערימות או עזרי שחזורים 3-D בצפיית מטוסי מוקד מרובים, אבל עדי?...

מחקר של melanogaster תסיסנית סיפק תובנות גדולות לרגולציה הגנטית של מגוון רחב של תופעות. בפרט, חל מחקר מקיף על התפתחות ביצית, כי אאוגנזה מספקת דרך צייתנית לחקור תהליכים רבים ושונים התפתחותיות, כוללים דפוסי רקמה, שינויי קוטביות תא, מיתוג מחזור התא, ורגולצית translational 1,2,3,4. אירוע morphogenic אחד חשוב במהלך אאוגנזה הוא המפרט, הרכישה של תנועתיות, וההגירה של קבוצה של תאים הנקראים תאי גבול (שנסקרו ב5). מאז נדידת תאים הוא תכונה מרכזית של המורפוגנזה בעלי החיים, ובגלל הרגולציה הגנטית של תהליך זה נשמרת היטב, מנגנונים שנקבעו בזבובים עשויים להיות חשוב בהקשרים אחרים. לפיכך, אנו חוקרים את השליטה המולקולרית של נדידת תאי גבול. ללימודים שלנו, פיתחנו שיטה חדשה כדי לבחון את הקטבים הקדמי של פיתוח ביצים,שבו תאי גבול להתעורר, לבחון כיצד הם מפתחים בפירוט. בתוך השחלה, תאי ביצה בשלבי התפתחות שונים קיימים לאורך שרשרות נקראות ovarioles, שנארזות בנדן דק (איור 1 א). כל תא ביצה ימשיך ליצור ביצה אחת. במהלך אאוגנזה, כמה סוגי תאים שונים חייבים לפתח באופן מתואם. ד תא ביצת melanogaster מורכב מ -16 תאי נבט-קו, כוללים ביצית אחת, מוקף בשכבה אחת אפיתל זקיקי 6. מספר קטן של תאים מיוחדים, הנקרא תאים קוטביים, להתעורר בקטבים הקדמי והאחוריים של האפיתל. תאי הגבול 6-8 מקורן באפיתל הקדמי של תא הביצה, הנגרם על ידי התאים הקוטביים 5,7. באמצע אאוגנזה-(שלב 9), תאי הגבול להתנתק משכניהם ולהעביר בין תאי האחות להגיע לביצית באחורית של תא ביצת 5,7. תנועה זו חייבת להיות מושלמתבעוד תאי הגבול יישארו בקבוצה שסבבה את שני תאים קוטביים שאינו ניע, מה שהופך את זה סוג של נדידת תאים קולקטיבית. הגירה מוצלחת של אשכול תא הגבול מבטיחה התפתחות תקינה של micropyle של קליפת הביצה, אשר הכרחית להפריה. תאי הקוטב הקדמי להורות גורל תא גבול על ידי הפעלת מפל הולך אותות. תאים קוטביים להפריש ציטוקינים, מזווג (UPD), אשר נקשר לקולטן הטרנסממברני, Domeless (DOME), על תאי שכני זקיק בשלב 8 של פיתוח ביצית 8,9. הכריכה של UPD גורם טירוזין קינאז יאנוס (JAK) לphosphorylate מתמר האותות וActivator של תמלול (STAT) 8,10,11. STAT לאחר מכן עובר לגרעין כדי להפעיל שעתוק. תאים איטיים גבול (SLBO) הוא גורם שעתוק שהוא יעד תעתיק ישיר של STAT וגם נדרש לתא גבול הגירה 12. צפיות ברוחב של תאי ביצה מצביעות tפעילות STAT כובע מוסדרת בשיפוע פני האפיתל הקדמי 8,11,13. יש תאי זקיק הקרובים ביותר לתאים הקוטביים הרמות הגבוהות ביותר של STAT הופעל, כך הם הופכים לתאי גבול ולפלוש לרקמות נבט-הקו הסמוכים. כדי להבין כיצד תאי הגבול מפורטים ובלהתנתק מהאפיתל, אנחנו צריכים לבחון כיצד הרקמה מאורגנת. אם אנו רואים את תאי ביצה מנקודת מבט קדמי-על, שהיינו מצפה סימטריה הרדיאלית של פעילות STAT בתאי הזקיק המקיפים את התאים הקוטביים. קצה בתצוגה גם באופן מדויק יותר להראות הבדלים של חלבונים בממברנה וממשקי תאי תאים לפני ובמהלך הניתוק מהשוואת תאים במטוסי מוקד שונים. בגלל תאי ביצה מוארכים ומחובר זה לזה על ידי תאי גבעול, הם להתיישב על גבי שקופיות רוחבית, ולכן קשה לבחון את הארכיטקטורה הקדמית. לפיכך, מידע רב על התאים בקטבים של תא הביצה ישכבר משתמע מנופים לרוחב. למרות שניתן להשיג קצת מידע דרך שחזורים אלגוריתמיים 3-D של חלקים אופטיים, פיזור אור, photobleaching, וגבולות עניים יותר של רזולוציה בציר Z-להפוך את המידע הזה פחות מפורט ואמין, בהעדר טכניקות יקרות כמו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר 14 . סוגים אחרים של הדמיה מבוססת סעיף (למשל, במיקרוסקופ אלקטרונים או חתך microtome) דורשים מניפולציה נרחבת של רקמות, כולל התייבשות, ויגדיל את הסבירות לחפצים. לפיכך, פיתחנו שיטה חדשה לתמונת ד תאי ביצת melanogaster תוך זקוף. שיטה זו כבר הוכיחה שימושית בהבהרה כיצד תאי ניעתי נגזרו (ראה תוצאות נציג ומאנינג et al, הנסקר), והוא צפוי להיות באופן רחב יותר יקר במחקרים של היבטים אחרים של אאוגנזה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:348px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:279px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:283px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:348px;">0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)</td>
			<td style="width:279px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:283px;">Add 3.1 g of NaH2PO4&#8226;H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:348px;">16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade</td>
			<td style="width:279px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>methanol-free to preserve GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">30G x 1/2 inch needle&#160;</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305106</td>
			<td>Regular bevel</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:348px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:279px;">Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten female flies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:279px;">PAA-cell culture company</td>
			<td style="width:119px;">A15-701</td>
			<td>Used in NP40 Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:279px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td style="width:283px;">Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:283px;">5mg/ml stock solution&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:283px;">Added to supplement dissection medium (10%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:348px;">Glass culture tube</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>47729-576</td>
			<td>14mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glass Depression Slides</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>470019-020</td>
			<td>1.2 mm Thick, Double Cavity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glycerin Jelly&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Electron Microsocpy Sciences</td>
			<td>17998-10</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glycerol</td>
			<td style="width:279px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB15760</td>
			<td>70% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I3021-500ML</td>
			<td style="width:283px;">(interchangable for Nonidet P-40)&#160; Used in NP40 Wash Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Leica Fluorescent Stereoscope&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Leica SP5 Confocal Microscope</td>
			<td style="width:279px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>40x/0.55NA dry objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82027-518</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Microknife&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Roboz Surgical Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;">37-7546</td>
			<td>45&#7506; angle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">16004-368</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:348px;">NP40 Wash Buffer</td>
			<td style="width:279px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:283px;">50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Added to supplement dissection medium (0.6X)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Petridish- Polysterine, sterile</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>60Wx15H mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3813-10PAK</td>
			<td>10 packs of Powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3786-500G</td>
			<td>Used in 0.1M KPO4 Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791-500G</td>
			<td>Used in 0.1M KPO4 Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Schneider&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"> 
			11720018</td>
			<td>With L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:348px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td>Used in fluorescent antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S3014-500G</td>
			<td>Used in NP40 Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">TRIS-HCL</td>
			<td style="width:279px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB70144</td>
			<td>1M TRIS-HCL, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td style="width:279px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For processing confocal Z-stacks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

upright imaging of drosophila egg chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

שיטת ההדמיה הזקופה אפשרה לנו לראות באופן ישיר את הארגון של תאים באפיתל הזקיקים הקדמי בשלב 8. סמן כללי לגורל תא זקיק, העיניים נעדרות (EYA) חלבון, כמו גם את סמן DNA הגרעיני DAPI, הראה גם ביטוי על פני תחום זה של תאים, והוכיח כי כל התאים ניתן היו לראות עם עוצמות צביעה דומות (אי?...

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

7.5K Views.  University of Maryland Baltimore County. The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Video: Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.