פרוטוקול זה מספק דרך מהירה להערכת ההשפעות של הפלת הגן WC5, שהוא הגורם הנפוץ ביותר לאפילפסיה מוקדית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להשתמש בו כדי להעריך את האפילפסיה, כמו פנוטיפ באמצעות תכונות התנהגותיות ופיזיולוגיות בשלבים שונים של התפתחות. יום אחד לפני הזרקת המיקרו, הקם את מיכלי ההזדווגות של דגי הזברה.
בבוקר ההזרקה, להסיר את המחווצים כדי לאפשר השרצה. השתמש מסננת בסדר כדי להעביר את הביצים לתוך 100 מילימטר פטרי מנות, מלא במי עובר. בעזרת צינור פסטר מפלסטיק, פיק 60 עד 80 ביצים, ומסדרים את הביצים בצלחת פטרי מצופה סיליקון להזרקה.
אנחנו מעבירים את רוב המים, משאירים מספיק כדי לכסות את הביצים באמצע הדרך. מניחים מחט זכוכית אנכית לתוך צינור של פתרון הזרקה. אפשר לפתרון הצבעוני למלא את הצינור על ידי פעולה נימית על פני תקופה של מספר דקות.
כאשר פתרון ההזרקה נראה בקצה המחט, לעלות את המחט על ידית ההזרקה של מזרק מיקרו, ולהדליק את מדחס האוויר. התאם את הגדרת הלחץ כדי ליצור נפח הזרקת שני ננו-ליטר. ולהניח את הביצים תחת מיקרוסקופ דו-עיני מנתח, עם הגדלה של פי ארבעה.
הכנס את קצה המחט דרך הכוריון והחלמון של עוברים בשלב אחד כדי להזריק את הפתרון ישירות בתוך כל תא. לאחר מכן מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי 100 מ"מ מסומנת של מי עובר, ומניחים את הצלחת בחממה של 28 מעלות צלזיוס. 28 שעות לאחר ההפריה, מניחים רשת רשת פלסטיק 1.2 על 1.2 מילימטר בתחתית צלחת הבדיקה.
השתמש פיפטה פסטר פלסטיק למקם 10 עד 12 עוברים בתוך chorions שלהם על רשת הפלסטיק. מלאו את המנה במספיק מי עובר כדי לשמור על העובר שקוע, אך לא צף, בזהירות להזיז את העוברים עם קצה פלסטיק למיקום על הרשת לפי הצורך. לאחר מכן, באמצעות מצלמת וידאו המחוברת למיקרוסקופ ניתוח, להקליט את פעילות הסליל ספונטני במשך 10 עד 20 דקות.
כדי לנתח את התנועה הספונטנית הכוללת, השתמש במודול כימות הפעילות במערכת מעבדת זברה כדי להעלות את הסרטון המוקלט ולעצב את זירות המעקב סביב כל עובר בהתאם לצורך. הגדר את סף ההקפאה והתפוצץ ל- 10 ו - 50 בהתאמה. וכאשר ניתוח הווידאו האוטומטי, אשר כימת את הפעילות הכוללת בתוך כל אחת מהזירות המוגדרות.
לאחר מכן שחזר את ערכת הנתונים כגליונות אלקטרוניים כדי לבצע את הניתוח, באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים המתאימה. 46 שעות לאחר ההפריה, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לפורר את העוברים, ומלאו צלחת בדיקה של 130 מ"מ במי עובר. לפחות 15 דקות לפני השאר, לחמם את צלחת הבדיקה בחממה 28 מעלות צלזיוס.
כדי לבצע בדיקת תגובת בריחה מעוררת מגע, השתמש בפיפטת פסטר מפלסטיק כדי למקם עובר במרכז צלחת הבדיקה, מתחת למצלמה. התחל את ההקלטה, באמצעות קצב רכישה של 30 פריימים לשנייה. בעזרת קצה פלסטיק עדין, יש לגעת מעט בזנב העובר בתנועת הבהוב.
עצירת ההקלטה, כאשר הזחל הפסיק את תנועתו. לאחר מכן, להעביר את העובר לצלחת החזקה חדשה מלאה במי עובר טריים, ולחזור על הבדיקה עם כמה שיותר עוברים לפי הצורך עבור כל מצב ניסיוני. כדי להכין את דג הזברה לניתוח אלקטרופיזיולוגי, מניחים אחד, ארבעה עד שישה ימים לאחר ההפריה בצלחת פטרי תחתונה לכוס.
הסר כל עודף, מלח נוסף בינוני כדי להבטיח כי הדג יהיה קרוב ככל האפשר לתחתית המנה. השתמש פיפטה פסטר פלסטיק כדי להוסיף מספיק אגרו נוזלי חם כדי לכסות את הזחל. בעוד האגרוס מתקשה, השתמש במלקחיים עדינים כדי לכוון את צד הגחון של הדג למטה במרכז המנה.
לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של פתרון הקלטה, המכיל 10 pancuronium ברומיד מיקרומולרי לצלחת כדי לחסום שידור עצבי-שרירי. לאחר מכן, מלא מיקרופיפיטינג בתמיסת הקלטה, והשתמש במגבר מהדק תיקון בתצורת מלחצי המתח, כדי למדוד את עמידות האלקטרודה באמבטיה כדי לאשר את ערכו הנכון. באמצעות מטרה של 20x, מקם את ראש הזחל בשדה הראייה המרכזי, והנמיך את המיקרופיט כדי להגיע לעמדת ההקלטה בתוך הקטטום האופטי.
החלף את מגבר הידוק התיקון לתצורת המהדק הנוכחית ותקן את זרם ההחזקה לאפס מיליאמפר. באמצעות מסנן מעבר נמוך של קילוהרץ אחד, וקצב רכישה של קילוהרץ אחד, ורווח דיגיטלי של 10, מתעדים את הפעילות הספונטנית של הדג במשך 60 דקות כדי לקבוע את רמות הפעילות הבסיסית. בסוף ההקלטה הבסיסית, ב 143 microliters של 300 מילימולר לליטר פתרון פנטילנטטרזול לאמבטיה, לריכוז סופי של 20 מילימולר לליטר.
להקליט את הפעילות העצבית של החיה בתמיסת pentylenetetrazole במשך 120 דקות נוספות. במהלך תקופת הבסיס של ההקלטה, ארבעה עד שישה ימים לאחר ההפריה מודלים אפילפטיים דגי זברה מדגימים מופע גבוה יותר של אירועים ספונטניים, בעוד דגים שליטה לא תואמים מציגים מעט מאוד תנודות. לאחר יישום pentylenetetrazole, הן בקרת אי התאמה מודלים אפילפטיים דגי זברה להפגין מספר גדל וגביר של אירועי קיטוב עמוק.
במהלך התקופה הראשונה לאחר יישום pentylenetetrazole, שיעור של 0.8 אירועים לדקה הוא ציין הן שליטה לא תואמת להפיל בעלי חיים אשר רוב האירועים הם של משרעת גבוהה. במהלך תקופת התגובה האחרונה. קצב אירועי ההפחתה עולה לסביבות אירוע אחד בדקה.
ורוב האירועים הם של משרעת נמוכה. בעת ביצוע להפיל, חשוב מאוד לקבוע את המינון הנכון של morpholinos באמצעות עקומת תגובת מינון ולבצע פקדים כדי למנוע רעילות לא מינית. דחיפה זו כדי לאפשר מספר מחקרים במורד הזרם, כולל בדיקת ההשפעות של מכפילים גנטיים או כימיים.
והתנהגות דגי הזברה ופעילות הפעילויות העצביות כדי להבין את ההשפעות ההתפתחותיות של חמש המוטציות של DC.
