הפרוטוקול שלנו מספק זרימת עבודה פשוטה יותר עבור סטרפטומיצ'ס ונצואלה - תרגום תמלול ללא תאים. המערכת שלנו רותמת את האנזימים והמסלולים המטבוליים מהאורגניזם הלא-מודלי הזה. היתרונות העיקריים הם הביטוי ההטרולוגי של גנים עם תוכן GC גבוה, מתן סביבת העברת חלבונים נוחה, ומערכת פתוחה לכוונון עדין של מסלולים biosynthetic.
השיטה שלנו תפתח הזדמנויות חדשות לחקר סטרפטומיצ'ים וחיידקי GC גבוהים הקשורים. זה מאפשר לחקור אנזימים וביטוי גנים בחיידקים אלה. טכניקה זו פותחה כדי להקל על היישום על ידי משתמשים חדשים.
הצעד היחיד שדורש ניסיון קודם או היכרות הוא sonication לייצר תמציות גולמיות פעילות מאוד. כדי להתחיל לקצור את התאים בתרבית מראש ביום השלישי, לדלל את תרבית הלילה ביחס של אחד ל -10 עם מדיום GYN טרי עבור צפיפות אופטית או מדידת OD ב 600 ננומטר. אם OD של התרבות ב 600 ננומטר הוא פחות מ 0.3, להגדיל את מהירות הרעידות ל 250 עד 300 סיבובים לדקה ולגדול עד OD מגיע 0.3.
לגדול במשך לא יותר משעתיים נוספות. אם OD גדול מ-0.3, העבירו את התרביות למיכלי צנטריפוגה והתקררו במהירות על קרח רטוב למשך 30 דקות. בזמן ההמתנה לתרבות התאים להתקרר, להכין ארבעה מיליליטרים של טרי אחד טוחן dithiothreitol, S30A ו S30B חוצצים ולשמור אותם על קרח.
לאחר שקילה צינור צנטריפוגה ריק 50 מיליליטר, מראש לצנן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. מוסיפים שני מיליליטרים של dithiothreitol טוחן אחד לליטר אחד של חיץ S30A על קרח ומערבבים היטב. צנטריפוגה התאים ב 6, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant בתנועה מהירה, להוסיף 250 מיליליטר של חיץ S30A ו resuspened התאים על ידי ניעור בקבוקי צנטריפוגציה במרץ עד גושי התא מפוזרים הומוגנית. ואז צנטריפוגה התאים שוב במשך שש דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולחזור על התוספת של מאגר S30A, ואחריו צנטריפוגה כפי שהוכח.
לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של DTT טוחן אחד לליטר אחד של חיץ S30B על קרח ומערבבים היטב. הוסף 250 מיליליטר של מאגר S30B לתאים וחזור על צנטריפוגה. Resuspend את גלולה התא ב 10 מיליליטר של מאגר S30B ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ששוקלל מראש מראש.
במידת הצורך, להעביר את התאים השיוריים עם חמישה עד 10 מיליליטר נוספים של מאגר S30B ולמלא את הצינור לנפח 50 מיליליטר עם S30B. צנטריפוגה התאים במשך 10 דקות. השלך את supernatant ולחזור על צנטריפוגה בהגדרות קודמות כפי שהודגם.
לאחר השלכת supernatant, לשאוף את S30B supernatant הנותרים עם פיפטה 100 עד 200 microliter ולשקול את גלולה התא הרטוב. עבור כל גרם אחד של תאים רטובים, להוסיף 0.9 מיליליטר של מאגר S30B. הגדילו מחדש את התאים באמצעות פיפטת פסטר או מערבולת.
צנטריפוגה לזמן קצר במשך כ 10 שניות עד 500 G כדי לשקם את התאים. מנמיכים את קצה sonicator לתוך ההשעיה התא עד הקצה הוא כ סנטימטר אחד מתחת לפני השטח הנוזלי. קלט פרמטרים שונים בהגדרות sonicator.
הגדר את התדירות ל-20 קילוהרץ, משרעת ל-65% דופק בזמן לסירוגין ל-10 שניות, וזמן sonication כולל לדקה אחת. התחל sonication ולהזיז את הצינור למעלה או למטה לצדדים במהלך שני מחזורי המנוחה הראשונים כדי להבטיח את התאים הם sonicated באופן שווה. אם התאים אינם lysed מלא, להפוך את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים ולחזור על sonication עבור מחזור נוסף אחד או שניים 10 שניות עם ערבוב תכוף עד התאים הם שיבשו לחלוטין.
צנטריפוגה התאים lysed כדי להסיר את פסולת התא, ולאחר מכן להעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge כמו aliquot מיליליטר אחד. לתגובת נגר של תמציות התא, לדגור על התא המכיל את תמצית התא ב 30 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות על בלוק חום או באינקובטור ללא שייקר. לתגובת תרגום שעתוק, להפשיר את תמצית התא SMM או תמיסת MES ו- DNA plasmid על קרח.
לפני לצנן צלחת 384-well ב מינוס 20 מעלות צלזיוס. הגדר את תגובת תרגום שעתוק על הקרח שבו 25% מהנפח הוא DNA פלסמיד, 33.33% הוא תמצית תאים ו 41.67% הוא פתרון SMM. מערבבים בעדינות את התערובת במשך כחמש שניות בסביבה במהירות נמוכה כדי להבטיח את הפתרון הוא הומוגני תוך הימנעות קצף או היווצרות בועות.
העבר שלושה aliquots של 10 microliters לשלוש בארות של צלחת 384 באר כמו משולש טכני מבלי להציג בועות אוויר. לאחר איטום הצלחת עם כיסוי שקוף, לסובב את הצלחת ב 400 פעמים G במשך חמש שניות ולדגור את התגובה ב 28 מעלות צלזיוס או באינקובטור או קורא צלחת בלי לרעוד. תרגום שעתוק ללא תאים של סטרפטומיצ'ס ונצואלה עבר אופטימיזציה לביטוי תפוקה גבוהה של חלבונים פלואורסצנטיים מהפלסמיד הסטנדרטי pTU1-A-SP44, כמו גם אנזימים ביוסינתזה שזוהו על ידי אלקטרופורזה ג'ל.
הביטוי של pTU1-A-SP44-mScarlet-I פלסמיד סטנדרטי נמדד באמצעות מספר שיטות. מדידות הפלואורסצנטיות בזמן אמת של mRNA באמצעות aptamer dBroccoli RNA, חלבון mScarlet-I לא בוגר באמצעות מערכת תג FlAsH, וחלבון mScarlet-I בוגר בוצעו. כתמי הפלואורסצנטיות בג'ל של mScarlet-I באמצעות תג FlAsH נערכו בנוסף להכתמת Coomassie Blue של סך החלבון ללא תאים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות פעילות לחקר אנזימים ומסלולים מאתגרים בשיטות סטנדרטיות. זה גם משתרע לקראת ביוסינתזה מוגדלת וביטוי גנים תפוקה גבוהה. אנו מפתחים טכניקה זו כדי לחקור אנזימים מטבוליים מחיידקי GC גבוהים.
הראינו את הפוטנציאל של המערכת שלנו לחקור ביוסינטזה מוגדלת בתגובות ללא תאים.
