פרוטוקול זה מתאר כיצד להנדס צמתים עצביים-שריריים אנושיים תלת-ממדיים במבחנה פונקציונליים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור פתולוגיות נוירומוסקולריות ולבחון טיפולים פוטנציאליים. טכניקה זו משתמשת בגירוי אופטוגנטי סימולטני ובעיבוד וידאו. הוא מכמת את השינויים בתפקוד הצומת העצבי-שרירי במהלך ההתפתחות ובשל גורמים חיצוניים, כגון נוירוטוקסינים וסרום ממטופלי מיאסטניה גרביס.
השלבים המערבים את תא השריר ואת זריעת הנוירונים המוטוריים לתוך הביוריאקטור יכולים להיות מאתגרים בהתחלה. שמירה על תערובת ג'ל הקולגן על קרח יכולה לעזור להאריך את הזמן הזמין לזריעה של כל התאים לפני שהג'ל יתמצק. התחילו בערבוב בסיס של 10 ל-1 לתערובת חומרי ריפוי של פולידימתילסילוקסן, או PDMS, והכניסו את התערובת לתא ואקום.
סגור את כל השסתומים והפעל את הוואקום כדי לדגה את התערובת למשך 30 דקות לפחות עד שלא יישארו בועות אוויר. יוצקים את התערובת לתבניות ומפחיתים את התבניות בתא הוואקום למשך שעה, ואז סוגרים את התבניות עם החצי העליון של התבנית בכיוון הנכון. מניחים מוט פלדה משושה מעל המרכז ומהדקים משני הצדדים.
לאחר מכן, מלאו מחדש את החלק העליון ב-PDMS ורפאו את התבניות בתנור של 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות. לאחר שהתבניות התקררו לטמפרטורת החדר, הסירו את הפלטפורמות מהתבניות. בינתיים, כיסוי הזכוכית מחליק בפוליאול פעילי שטח שאינו יוני במשך 30 דקות, מה שמבטיח שהחלקות הכיסוי לא ייערמו וכולן מצופות כראוי, ואז ישטפו אותן היטב במים מזוקקים ויבשו אותן למשך הלילה ב-65 מעלות צלזיוס.
טפלו בתלושי כיסוי הזכוכית ובפלטפורמת PDMS באמצעות שואב פלזמה גבוה עם 6 ליטר לדקה של חמצן למשך דקה עד שתי דקות. לאחר הטיפול, קשרו את השניים זה לזה על ידי לחיצה על ה-PDMS כלפי מטה על החלקת הכיסוי למשך 30 שניות לפחות. מכינים תערובת של 4 ל-1 של 3 מיליגרם למיליליטר קולגן 1 ומטריצת קרום מרתף מסוללת, ואז משחזרים את המיובלסטים בתערובת הקולגן הטרייה הזו.
לאחר מכן, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של תרחיף קולגן-תאי זה לכל תא שריר של הביוריאקטור, והקפידו לפזר את המתלים על פני שני העמודים באמצעות קצה הפיפטה. אפשרו לתערובת ג'ל התאים להתפלמר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז מלאו כל ביוריאקטור היטב ב-450 מיקרוליטרים של מדיית גדילה מיוטונית. ביום 11 של התמיינות motoneuron, להעביר את התאים ואת המדיה לצינור 50 מיליליטר ולאפשר לנוירוספרות להתיישב לקרקעית במשך 5 דקות.
לשאוף לסופרנאטנט ולהחיות את התאים ב-15 מיליליטרים של מדיום תרבית ההשעיה של מוטונרון בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח ו-10 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה. ביום ה-14 של פרוטוקולי ההבחנה, זרעו את המוטונאורונים לתוך הפלטפורמה. הכינו תערובת ג'ל של 4 ל-1 של 2 מיליגרם למיליליטר קולגן 1 ומטריצת קרום מרתף סולובילית.
השתמשו במסננת תאים של 400 ננומטר כדי לבחור נוירוספרות גדולות ולהחיות אותן בתערובת הג'ל המוכנה. שאפו בזהירות את המדיה מהמאגר ומהנוירוספרה היטב, ואז הוסיפו 15 מיקרוליטרים של תערובת הג'ל לתעלה הנוירוספרית. טענו פיפטה של 10 מיקרוליטר עם 10 מיקרוליטרים של ג'ל ובחרו נוירוספרה אחת.
הפקידו את הנוירוספרה בתעלה הנוירוספרית, כדי להבטיח שהיא נמצאת בתא, ואז הרימו באיטיות את הפיפטה תוך שחרור הג'ל הנותר לאחר הפקדת הנוירוספרה. אפשרו לג'ל להתפלמר במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ואז הוסיפו למאגרים 450 מיקרוליטרים של NbActiv4 בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח ו-10 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה. לצורך הדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם תוכנת מצלמה מדעית משלימה של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת.
הגדר את ה-Binning ל-2 על 2, חשיפה ל-20 אלפיות השנייה, הפעלת תריס גלגול, קצב קריאה ל-540 מגה-הרץ, טווח דינמי ל-12 סיביות ורווח 1 ומצב חיישן לחפיפה. השתמש במטרה פי 2 במיקרוסקופ כדי לדמות את המיקרוטיסים ולחבר תא חי לשלב המיקרוסקופ. בחר את אזור העניין המכיל את רקמות השלד העצבניות כדי למזער את גודל הקובץ ואת זמן העיבוד שלו, ולאחר מכן מקם מסנן פליטה ארוך של 594 ננומטר בין הדגימה לבין מטרת ההדמיה כדי לסנן את פולסי האור הכחול מהמצלמה.
לאחר מכן, הניחו צלחת מלבנית בעלת 4 בארות המכילה ארבעה ביוריאקטורים לתוך תא התאים החיים, ולאחר מכן לחצו על תצוגה חיה ומרכזם ומקדו את התמונה בהחזר ההשקעה הרצוי. הורד את קוד המאקרו המותאם אישית מתיקיית GitHub כדי לשלוט במיקום הבמה, בלוח Arduino וברכישת הווידאו, ולאחר מכן הגדר את סרט הפלט כקו התחתון של קבוצת רקמות קו תחתון של קבוצת רקמות יום קו תחתון שם רקמות קו תחתון נקודת ניסוי ND2. הפעל את קוד המאקרו עם הקואורדינטות הרצויות X ו- Y המוצבות על הבמה וקבל הפסקה מהירה בזמן עם 1700 פריימים ב- 50 פריימים לשנייה.
לאחר ההדמיה, החליפו את המדיה והחזירו את הדגימות לחממה. אפשרו לפחות 24 שעות בין מפגשי רכישת התמונה כדי למנוע עייפות רקמות. לעיבוד סרטים, הורד את הקבצים מתיקיית GitHub והשתמש בקוד MATLAB המותאם אישית כדי לעבד את הסרטונים בניתוח אצווה.
פתח סקריפט ניתוח מערכת הפעלה רקורסיבי כדי שכל הסרטונים שנרכשו יהיו באותה תיקיה. התאם את הפרמטרים שלפני הניתוח והפעל את הסקריפט recursiveOSAnalysis כדי לנתח את הסרטים באמצעות עיבוד מקבילי. התאם את הפרמטרים שלאחר הניתוח כגון זמן בסיס, סף שיא, בולטות דקה-דקה ורוחב דקה-דקה לפי הצורך.
לבסוף, צור פלט וידאו וגרף על ידי הפעלת RECURSIVEOSMovie כדי ליצור קובץ וידאו עבור כל רקמה עם עקבות התכווצות המתאימים שלה. פרוטוקול זה נבדק באמצעות שתי מערכות בעלות קשקשים שונים, מכשיר מיקרופלואידי המניב רקמות שריר שלד באורך 1 מילימטר הכוללות כ-20, 000 מיובלסטים ומערכת ביו-ריאקטור פתוחה היטב וכתוצאה מכך רקמות שריר באורך 4 מילימטרים הכוללות כ-450 מיובלסטים. מערך אופטי נבנה כדי לאפשר גירוי מבוקר של motoneurons עם אור כחול ופונקציית NMJ הוגבהה באמצעות סקריפט מאקרו של מיקרוסקופ מותאם אישית בשילוב עם קוד Arduino מותאם אישית.
קוד זה כולל פרמטרים מתכווננים הניתנים לכוונון וקובע אם כיווץ מופעל על סמך הזמן שבין פולס האור לתחילת שיא ההתכווצות. המערכת תפסה שיפור בתפקוד NMJ ברקמות שהראו עלייה בתגובות המופעלות שבוע לאחר ייצור הרקמות, ולאחר מכן פונקציה יציבה במשך שבוע נוסף. אלפא-בונגארוטוקסין עצר את כל הצירים המופעלים והספונטניים וכתוצאה מכך נוצר שיבוש מוחלט של תפקוד NMJ, והוכיח כי גירוי קל של הרקמות דורש NMJ תפקודי.
ניתוח הרקמות שטופלו בסרום 20% myasthenia gravis במשך 48 שעות הראה ירידה בתפקוד בהשוואה לרקמות בקרה שטופלו בסרום מתורמים בריאים. 48 שעות לאחר הסרת הנסיוב ושטיפתו, ה-NMJs המהונדסים הראו התאוששות של תפקוד. וודאו שכל הביוריאקטורים נמצאים בתנור למשך זמן שווה כדי למנוע שונות של נוקשות בין אצוות.
כמו כן, הקפד לאמת את זריעת הנוירונים המוטוריים באמצעות המיקרוסקופ. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות סקר מטא-בלומיקה, פרוטאומיקה וקריספר כדי לאסוף מידע נוסף ולהבין טוב יותר את השינויים המכניסטיים הנגרמים על ידי סרום חולה.
