Dieses Protokoll beschreibt, wie funktionelle 3D-In-vitro-humane neuromuskuläre Verbindungen entwickelt werden können, die zur Untersuchung neuromuskulärer Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Diese Technik verwendet simultane optogenetische Stimulation und Videoverarbeitung. Es sind quantifizierte Veränderungen der neuromuskulären Übergangsfunktion während der Entwicklung und aufgrund externer Faktoren wie Neurotoxine und Serum von Myasthenia gravis-Patienten.
Die Schritte, bei denen die Muskelzelle und die Motoneuronenaussaat in den Bioreaktor einfließen, können zunächst eine Herausforderung darstellen. Das Aufbewahren der Kollagengelmischung auf Eis kann dazu beitragen, die Zeit zu verlängern, die zur Verfügung steht, um alle Zellen zu säen, bevor das Gel erstarrt. Beginnen Sie mit dem Mischen einer 10-zu-1-Base-zu-Härter-Mischung aus Polydimethylsiloxan oder PDMS und legen Sie die Mischung in eine Vakuumkammer.
Schließen Sie alle Ventile und schalten Sie das Vakuum ein, um das Gemisch für mindestens 30 Minuten zu entgasen, bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind. Gießen Sie die Mischung in Formen und entgasen Sie die Formen in der Vakuumkammer für 1 Stunde, dann schließen Sie die Formen mit der oberen Hälfte der Form in der richtigen Ausrichtung. Legen Sie eine sechseckige Stahlstange über die Mitte und klemmen Sie auf beiden Seiten.
Als nächstes füllen Sie die Oberseite mit PDMS auf und härten Sie die Formen in einem 65-Grad-Celsius-Ofen für mindestens 4 Stunden aus. Nachdem die Formen auf Raumtemperatur abgekühlt sind, entfernen Sie die Plattformen von den Formen. In der Zwischenzeit so Glasabdeckungsschlüsse in 1% nichtionischem Tensidpolyol für 30 Minuten, um sicherzustellen, dass sich die Deckscheine nicht stapeln und alle ordnungsgemäß beschichtet sind, spülen Sie sie dann gut mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie über Nacht bei 65 Grad Celsius.
Behandeln Sie die Glasabdeckscheine und die PDMS-Plattform mit einem Plasmareiniger auf hoher Höhe mit 6 Litern pro Minute Sauerstoff für 1 bis 2 Minuten. Nach der Behandlung verbinden Sie die beiden miteinander, indem Sie das PDMS mindestens 30 Sekunden lang auf den Deckzettel drücken. Bereiten Sie eine 4-zu-1-Mischung aus 3 Milligramm pro Milliliter Kollagen 1 und einer gelösten Basalmembranmatrix vor und resuspendieren Sie dann die Myoblasten in dieser frisch zubereiteten Kollagenmischung.
Als nächstes fügen Sie 15 Mikroliter dieser Zell-Kollagen-Suspension zu jeder Muskelkammer des Bioreaktors hinzu und achten Sie darauf, die Suspension mit der Pipettenspitze auf beide Säulen zu verteilen. Lassen Sie die Zellgelmischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius polymerisieren und füllen Sie dann jeden Bioreaktor gut mit 450 Mikrolitern myotoner Wachstumsmedien. Am Tag 11 der Motoneuron-Differenzierung übertragen Sie die Zellen und Medien in eine 50-Milliliter-Röhre und lassen Sie die Neurosphären für 5 Minuten auf dem Boden absetzen.
Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 Milliliter Motoneuron-Suspensionskulturmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophem Faktor aus dem Gehirn und 10 Nanogramm pro Milliliter von Gliazellen abgeleitetem neurotrophem Faktor. Samen Sie am Tag 14 der Differenzierungsprotokolle die Motoneuronen in die Plattform. Bereiten Sie eine 4-zu-1-Gelmischung aus 2 Milligramm pro Milliliter Kollagen 1 und einer gelösten Basalmembranmatrix vor.
Verwenden Sie ein 400-Nanometer-Zellsieb, um große Neurosphären auszuwählen und in der vorbereiteten Gelmischung zu resuspendieren. Saugen Sie die Medien vorsichtig aus dem Reservoir und der Neurosphäre gut ab und fügen Sie dann 15 Mikroliter der Gelmischung in den Neurosphärenkanal hinzu. Laden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette mit 10 Mikrolitern Gel und wählen Sie eine Neurosphäre.
Legen Sie die Neurosphäre in den Neurosphärenkanal ab, stellen Sie sicher, dass sie sich in der Kammer befindet, und heben Sie dann langsam die Pipette an, während Sie das verbleibende Gel freisetzen, sobald sich die Neurosphäre abgelagert hat. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius polymerisieren und fügen Sie dann 450 Mikroliter NbActiv4 hinzu, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophem Faktor aus dem Gehirn und 10 Nanogramm pro Milliliter aus Gliazellen stammendem neurotrophem Faktor zu den Reservoirs. Verwenden Sie für die Bildgebung ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einer wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiterkamerasoftware.
Stellen Sie das Binning auf 2 x 2, die Belichtung auf 20 Millisekunden, den Rollladen ein, die Ausleserate auf 540 Megahertz, den Dynamikbereich auf 12 Bit und die Verstärkung 1 und den Sensormodus auf Überlappung ein. Verwenden Sie ein 2-faches Objektiv am Mikroskop, um das Mikrogewebe abzubilden, und befestigen Sie eine Lebendzellkammer am Mikroskoptisch. Wählen Sie die Region von Interesse, die das innervierte Skelettgewebe enthält, um die Dateigröße und die Verarbeitungszeit zu minimieren, und platzieren Sie dann einen 594-Nanometer-Long-Pass-Emissionsfilter zwischen der Probe und dem Bildgebungsobjektiv, um blaue Lichtimpulse aus der Kamera herauszufiltern.
Als nächstes platzieren Sie eine rechteckige 4-Well-Platte mit vier Bioreaktoren in der Lebendzellkammer, klicken Sie dann auf Live-Ansicht und zentrieren und fokussieren Sie das Bild mit dem gewünschten ROI. Laden Sie den benutzerdefinierten Makrocode aus dem GitHub-Ordner herunter, um die Bühnenposition, die Arduino-Platine und die Videoerfassung zu steuern, und legen Sie dann den Ausgabefilm als Tag fest, der den Gewebegruppen-Unterstrich des Gewebenamens unterstrichen Experimentpunkt ND2 unterstreicht. Führen Sie den Makrocode mit den gewünschten X- und Y-Koordinaten auf der Bühne aus und erfassen Sie einen schnellen Zeitraffer mit 1700 Bildern bei 50 Bildern pro Sekunde.
Ersetzen Sie nach der Bildgebung das Medium und bringen Sie die Proben in den Inkubator zurück. Erlauben Sie mindestens 24 Stunden zwischen den Bildaufnahmesitzungen, um eine Ermüdung des Gewebes zu vermeiden. Laden Sie für die Filmverarbeitung die Dateien aus dem GitHub-Ordner herunter und verwenden Sie den benutzerdefinierten MATLAB-Code, um die Videos in der Stapelanalyse zu verarbeiten.
Öffnen Sie das rekursive Betriebssystemanalyseskript, um alle erworbenen Videos im selben Ordner zu haben. Passen Sie die Parameter vor der Analyse an und führen Sie das rekursive OSAnalysis-Skript aus, um die Filme durch parallele Verarbeitung zu analysieren. Passen Sie die Parameter nach der Analyse wie Baseline-Zeit, Peak-Schwellenwert, Min-Min-Prominenz und Min-Min-Breite nach Bedarf an.
Generieren Sie schließlich die Video- und Diagrammausgabe, indem Sie recursiveOSMovie ausführen, um eine Videodatei für jedes Gewebe mit seiner jeweiligen Kontraktilitätsspur zu generieren. Dieses Protokoll wurde mit zwei Systemen mit unterschiedlichen Skalen getestet, einer mikrofluidischen Vorrichtung, die 1 Millimeter langes Skelettmuskelgewebe mit etwa 20.000 Myoblasten liefert, und dem Open-Well-Bioreaktorsystem, das zu 4 Millimeter langem Muskelgewebe führt, das ungefähr 450 Myoblasten umfasst. Ein optisches Setup wurde entwickelt, um eine kontrollierte Stimulation von Motoneuronen mit blauem Licht zu ermöglichen, und die NMJ-Funktion wurde mit einem benutzerdefinierten Mikroskopmakroskript in Verbindung mit einem benutzerdefinierten Arduino-Code erhöht.
Dieser Code enthält abstimmbare einstellbare Parameter und bestimmt, ob eine Kontraktion ausgelöst wird, basierend auf der Zeit zwischen einem Lichtimpuls und dem Beginn des Kontraktilitätspeaks. Das System erfasste eine Verbesserung der NMJ-Funktion in Geweben, die eine Woche nach der Gewebeherstellung einen Anstieg der ausgelösten Reaktionen zeigte, gefolgt von einer stabilen Funktion für eine weitere Woche. Alpha-Bungarotoxin stoppte alle ausgelösten und spontanen Kontraktionen, was zu einer vollständigen Störung der NMJ-Funktion führte, was zeigt, dass die Lichtstimulation des Gewebes eine funktionelle NMJ erfordert.
Die Analyse der mit 20% Myasthenia gravis Serum behandelten Gewebe für 48 Stunden zeigte eine verminderte Funktion im Vergleich zu Kontrollgeweben, die mit Serum von gesunden Spendern behandelt wurden. 48 Stunden nach dem Entfernen und Auswaschen des Serums zeigten die entwickelten NMJs eine Wiederherstellung der Funktion. Stellen Sie sicher, dass sich alle Bioreaktoren für die gleiche Zeit im Ofen befinden, um Steifigkeitsschwankungen zwischen den Chargen zu vermeiden.
Achten Sie auch darauf, die Motoneuronenaussaat mit dem Mikroskop zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können Metabalomics, Proteomics und CRISPR-Screening durchgeführt werden, um zusätzliche Informationen zu sammeln und die mechanistischen Veränderungen, die durch erkranktes Serum verursacht werden, besser zu verstehen.
