Este protocolo descreve como projetar junções neuromusculares 3D in vitro in vitro que podem ser usadas para investigar patologias neuromusculares e testar potenciais terapêuticas. Esta técnica utiliza estimulação optogenética simultânea e processamento de vídeo. São mudanças quantificadas na função de junção neuromuscular durante o desenvolvimento e devido a fatores externos, como neurotoxinas e soro de pacientes com miasthenia gravis.
As etapas que envolvem a célula muscular e a semeadura do neurônio motor no bioreator podem ser desafiadoras no início. Manter a mistura de gel de colágeno no gelo pode ajudar a estender o tempo disponível para semear todas as células antes que o gel se solidifique. Comece misturando uma base de 10 para 1 para a mistura de agente de cura de polidimtilsiloxano, ou PDMS, e coloque a mistura em uma câmara de vácuo.
Feche todas as válvulas e ligue o vácuo para desgasar a mistura por pelo menos 30 minutos até que não permaneçam bolhas de ar. Despeje a mistura em moldes e desgas os moldes na câmara de vácuo por 1 hora, em seguida, feche os moldes com a metade superior do molde na orientação correta. Coloque uma haste de aço hexagonal sobre o centro e aperte em ambos os lados.
Em seguida, reabasteça a parte superior com PDMS e cure os moldes em um forno Celsius de 65 graus por pelo menos 4 horas. Depois que os moldes esfriarem até a temperatura ambiente, remova as plataformas dos moldes. Enquanto isso, a tampa de vidro desliza em políol surfactante não-iônico de 1% por 30 minutos, garantindo que os deslizamentos de cobertura não empilham e estejam todos devidamente revestidos, em seguida, enxágüe-os bem com água destilada e seque-os durante a noite a 65 graus Celsius.
Trate os deslizamentos de tampa de vidro e a plataforma PDMS usando um limpador de plasma no alto com 6 litros por minuto de oxigênio por 1 a 2 minutos. Uma vez tratado, una os dois pressionando o PDMS para baixo no deslizamento da tampa por pelo menos 30 segundos. Prepare uma mistura de 4 para 1 de 3 miligramas por colágeno mililitro 1 e matriz de membrana de porão solubilizada, em seguida, resuspenda as míobios nesta mistura de colágeno recém-preparada.
Em seguida, adicione 15 microliters desta suspensão de colágeno celular a cada câmara muscular do bioreator, certificando-se de espalhar a suspensão em ambos os pilares usando a ponta pipeta. Permita que a mistura de gel celular polimerize a 37 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, encha cada bioreator bem com 450 microliters de mídia de crescimento miotônico. No 11º dia de diferenciação de motoneuron, transfira as células e a mídia para um tubo de 50 mililitros e permita que as neurosferas se acomodem até o fundo por 5 minutos.
Aspire o supernasal e resuspende as células em 15 mililitros de cultura de suspensão de motoneurons complementados com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro e 10 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado de células gliais. No dia 14 dos protocolos de diferenciação, semeou os motoneurons na plataforma. Prepare uma mistura de gel de 4 a 1 de 2 miligramas por colágeno mililitro 1 e matriz de membrana de porão solubilizada.
Use um coador de células de 400 nanômetros para selecionar grandes neuroesferas e resuspensá-las na mistura de gel preparado. Aspirar cuidadosamente a mídia do reservatório e da neurosfera bem, em seguida, adicionar 15 microliters da mistura de gel no canal da neurosfera. Carregue uma pipeta de 10 microliteres com 10 microlitres de gel e escolha uma neurofera.
Deposite a neurosfera no canal da neurosfera, garantindo que ela esteja na câmara, e, em seguida, lentamente levante a pipeta enquanto libera o gel restante uma vez que a neurosfera é depositada. Deixe o gel polimerizar por 30 minutos a 37 graus Celsius, em seguida, adicione 450 microliters de NbActiv4 complementados com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro e 10 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado de células gliais aos reservatórios. Para imagem, use um microscópio fluorescente invertido com um software científico de câmera semicondutor de óxido de metal complementar.
Defina o Binning para 2-por-2, Exposição a 20 milissegundos, Obturador de rolamento ligado, Taxa de Leitura para 540 mega-hertz, alcance dinâmico para 12 bits e Gain 1 e Modo sensor para sobrepor. Use um objetivo 2x no microscópio para imaginar os microtissues e anexar uma câmara de célula viva ao estágio do microscópio. Selecione a região de interesse que contém os tecidos esqueléticos inervados para minimizar o tamanho do arquivo e o tempo de processamento e, em seguida, coloque um filtro de emissão de passe longo de 594 nanômetros entre a amostra e o objetivo de imagem de filtrar pulsos de luz azul da câmera.
Em seguida, coloque uma placa retangular de 4 poços contendo quatro bioreatores na câmara de células vivas, clique em visualização ao vivo e centro e concentre a imagem com o ROI desejado. Baixe o código macro personalizado da pasta GitHub para controlar a posição do palco, a placa Arduino e a aquisição de vídeo, em seguida, defina o filme de saída como o grupo de tecido de destaque do dia ressalta o nome do tecido sublinhar o ponto ND2 do experimento. Execute o código macro com as coordenadas X e Y desejadas definidas no palco e adquira um lapso de tempo rápido com 1700 quadros a 50 quadros por segundo.
Após a imagem, substitua a mídia e devolva as amostras para a incubadora. Deixe pelo menos 24 horas entre as sessões de aquisição de imagens para evitar a fadiga tecidual. Para processamento de filmes, baixe os arquivos da pasta GitHub e use o código MATLAB personalizado para processar os vídeos em análise em lote.
Abra o script de análise recursiva do SO para ter todos os vídeos adquiridos na mesma pasta. Ajuste os parâmetros de pré-análise e execute o script de análise recorrente dos OSanalysis para analisar os filmes através de processamento paralelo. Ajuste os parâmetros pós-análise, como tempo de linha de base, limite de pico, proeminência min-min e largura min-min, conforme necessário.
Finalmente, gere a saída de vídeo e gráfico executando o OSMovie recursivo para gerar um arquivo de vídeo para cada tecido com seu respectivo traço de contralução. Este protocolo foi testado usando dois sistemas com escalas diferentes, um dispositivo microfluido que produz tecidos musculares esqueléticos de 1 milímetro de comprimento, compreendendo aproximadamente 20.000 míobios e o sistema bioreator de poço aberto resultando em tecidos musculares de 4 milímetros de comprimento que compreendem aproximadamente 450 míomicas. Uma configuração óptica foi construída para permitir a estimulação controlada de motoneurons com luz azul e a função NMJ foi elevada usando um script de macro microscópio personalizado emparelhado com um código Arduino personalizado.
Este código inclui parâmetros ajustáveis e determina se uma contração é acionada com base no tempo entre um pulso leve e o início do pico de contração. O sistema capturou a melhora da função NMJ nos tecidos mostrando um aumento nas respostas desencadeadas uma semana após a fabricação do tecido, seguido por uma função estável por mais uma semana. A alfa-bungarotoxina parou todas as contrações desencadeadas e espontâneas resultando em uma interrupção completa da função NMJ, demonstrando que a estimulação leve dos tecidos requer um NMJ funcional.
A análise dos tecidos tratados com soro de 20% de miasthenia gravis por 48 horas mostrou diminuição da função em relação aos tecidos de controle tratados com soro de doadores saudáveis. 48 horas após a remoção e lavagem do soro, os NMJs projetados mostraram recuperação da função. Certifique-se de que todos os bioreatores estejam no forno por igual tempo para evitar a variabilidade da rigidez entre os lotes.
Além disso, certifique-se de verificar a semeadura do neurônio motor usando o microscópio. Após este procedimento, a triagem metabalômica, proteômica e CRISPR pode ser realizada para coletar informações adicionais e entender melhor as alterações mecanicistas causadas pelo soro doente.
